假丝酵母的添加对高盐稀态酱油有机酸含量影响

韩冉，张玲玲，黄文烨，龚佳欣，侯丽华

(天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457)

酱油起源于2500多年前的中国，是中国、日本和韩国等东亚国家最广泛接受的调味品[1]。由于其独特的口感和香气，它在世界西部地区的知名度正在急剧增长[2]。目前，我国酱油年产量约600万吨，占世界总产量的65%以上。我国酱油按其制备工艺的不同，分为高盐稀态发酵酱油(HLFSS)和低盐固态发酵酱油(LSFSS)。HLFSS的发酵工艺是在15～30 ℃下，经过陈化期(90～180 d)和较高的盐水溶液浓度(17%～20%)，而LSFSS的生产效率高、生产成本低，通常采用相对高温(40～55 ℃)的纯培养物，经过老化期(15～30 d)和较低的盐水溶液浓度(13%～15%)。因此，虽然LSFSS主导了中国酱油市场，但其风味品质普遍低于传统HLFSS，HLFSS在中国市场的份额一直在增加。

Sun等[3]采用HS-SPME研究了12个HLFSS样品中的挥发物，发现主要挥发物质是酸类和醇类，并且主要挥发性基团也属于酸类和醇类，分别占总含量的47%和14%[4]，这些研究结果表明HLFSS中酸类物质的含量与其风味息息相关。

HLFSS在发酵过程中可以通过添加耐盐酵母菌如假丝酵母(Candidaetchellsii)来增强酱油的风味品质。假丝酵母在酿造过程中，利用酿造原料，无需添加其他材料，就能够进行很好的发酵，主要作用是增酯增香，包括酸类、醇类、酯类、醛类和酚类等，其中酸类物质含量最高[5]。目前对于不同时间添加假丝酵母于HLFSS中有机酸含量的研究以及有机酸与酱油品质关系的研究相对较少。本文通过测定酸度和酸类物质，研究假丝酵母对HLFSS品质的影响，为酱油企业添加耐盐酵母提供了理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：豆粕、炒小麦。

菌种：米曲霉沪酿3.042、假丝酵母菌(Candidaetchellsii，C酵母)为本实验室保藏。

1.2 实验方法

1.2.1 假丝酵母生长曲线测定

将活化后的假丝酵母菌株转接至100 mL YPD无菌液体培养基中，在30 ℃下摇床(180 r/min)培养。每2 h取样，利用可见分光光度计(波长660 nm)测定菌液吸光度，以生长时间为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标，用软件绘制假丝酵母菌的生长曲线。

1.2.2 HLFSS制曲工艺

1.2.2.1 种曲的制备

以麸皮∶水为1∶1.1的比例拌水，灭菌处理后接种3～4环孢子，在30 ℃恒温堆积培养。15 h后振荡打散曲料，然后调温至30 ℃平铺培养，7 h后第2次振荡打散，3 d后将成熟种曲烘干备用。

1.2.2.2 大曲的制备

称取原料500 g(其中豆粕与炒小麦比为6∶4)，豆粕经(料液比为1∶1.1) 45 ℃无菌水浸泡30 min至充分吸水，随后原料经曲布包扎后进行高压灭菌处理。灭菌后将曲料及时打散，曲料温度降到40 ℃时拌入种曲(原料质量的0.4%)并充分混匀，在30 ℃堆积培养。12～16 h后第1次翻曲，继续培养6～8 h第2次翻曲。28 ℃进一步培养，培养40 h至大曲原料呈均匀的黄绿色，即为成曲。

1.2.3 发酵工艺

成曲收入发酵容器中，加入18%的盐水(原料干重的2.5倍)搅拌均匀，封口进行发酵，初始发酵温度15 ℃，每天升高1 ℃，30 ℃封顶，共发酵150 d，发酵过程中定期搅拌。分别在发酵第15天、30天和45天添加假丝酵母菌，添加量为2×105CFU/g。

1.2.4 酱油发酵过程中pH值和总酸的测定

发酵过程中每15 d进行一次取样，直至第150天。取样酱醪经8000 r/min条件下离心6 min后得上清。取上述酱汁10 mL，用pH计直接读数测定。总酸含量的测定按照国标GB/T 5009.39-2003[6]规定的方法测定。

1.2.5 发酵结束后相关指标的测定

1.2.5.1 液相色谱测定分析有机酸

色谱柱为Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm, I.D.)，流动相为0.03 mol/L KH2PO4(H3PO4调节pH值至3.0)，紫外检测器波长为215 nm，流速为0.5 mL/min，进样量为20 μL。

1.2.5.2 固相微萃取-气质联用(SPME-GC-MS)测定分析风味物质

GC条件：起始温度40 ℃，持续10 min后，先以3 ℃/min升温至100 ℃，然后以4 ℃/min升温至180 ℃，最终以6 ℃/min升温至220 ℃；进样口温度为250 ℃，以流速1 mL/min的氦气为载气，采用不分流进样的方式；MS条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，接口温度为220 ℃，离子源温度为230 ℃，扫描质量范围为33～450 amu[7]。

1.2.5.3 可溶性无盐固形物含量的测定

依据国标GB/T 18186-2000[8]中的方法进行分析。

2 结果与分析

2.1 假丝酵母的生长特性研究

接种终浓度为106个/mL的假丝酵母于YPD培养基中，假丝酵母的生长曲线见图1。从开始至4 h，假丝酵母生长处于初期，繁殖较迟缓；4 h后进入对数期，生长繁殖速度较快，活力较旺盛；20 h后菌液生长进入平稳期。最终实验选取6～16 h的假丝酵母菌液进行HLFSS的后续发酵。

图1 假丝酵母生长曲线Fig.1 The growth curve of Candida

2.2 HLFSS发酵过程中酸类物质相关理化指标的测定

2.2.1 发酵过程中pH值和总酸含量的监测

酱油在发酵过程中产生酸性物质，导致pH值逐渐下降，主要来自酱醪中产酸菌的繁殖，HLFSS通过醅盐水的作用，非耐盐菌逐渐死亡，耐盐菌存活，耐盐菌通过生长繁殖产生乳酸、琥珀酸等风味有机酸类，适量的酸性物质能够中和HLFSS中的咸味，然而总酸含量过高也可能降低酱油的感官品质[9-10]。

由图2中(a)可知，HLFSS在发酵开始后，pH值偏中性，发酵体系中酶活力总体较高，酱油原料中的蛋白质迅速被分解为多肽和氨基酸，并伴随产生大量乳酸、乙酸等酸类物质，使得pH值迅速下降；45 d后pH值的下降趋势逐渐减缓，并最终趋于平缓。空白组的pH值维持在5.0～5.5之间，假丝酵母添加组的pH值维持在4.5～5.0之间。发酵结束时pH值大小关系如下：45 d+C<15 d+C<30 d+C<空白。由图2中(b)可知，发酵开始后，总酸含量迅速增加，并在第90天时达到峰值，空白<30 d+C<15 d+C<45 d+C，分别为1.41，1.64，1.69，1.71 g/dL。发酵后期，有机酸被微生物利用生成酯类、醛类等风味物质，因此，发酵结束后的总酸含量为30 d+C<15 d+C<45 d+C<空白。

图2 HLFSS发酵过程中pH值的变化(a)和总酸的变化(b)Fig.2 The changes of pH values (a) and total acids (b) of HLFSS in the fermentation process

2.2.2 发酵结束后有机酸含量的测定

2.2.2.1 有机酸混合标准溶液液相色谱图及标准曲线的回归方程

混合10种有机酸标准品制成混合标准溶液，液相色谱图见图3，出峰顺序依次为：1-草酸、2-酒石酸、3-甲酸、4-苹果酸、5-乳酸、6-乙酸、7-柠檬酸、8-富马酸、9-琥珀酸、10-丙酸。10种有机酸的回归方程见表1。

图3 标准有机酸混合溶液液相色谱图Fig.3 The chromatogram of standard organic acid mixed solution

表1 有机酸回归方程Table 1 The regression analysis of organic acids

2.2.2.2 10种有机酸含量的测定

酱油的香气主要来自有机酸含量的高低，而且有机酸可以调节HLFSS高盐分带来的不适口感。酱油中的有机酸以乳酸、乙酸为主。本实验通过高效液相色谱法进行检测与分析，各个发酵组的有机酸含量见表2，各发酵组有机酸种类基本一致，其中草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸含量较高。琥珀酸入口呈爽口酸味；乙酸等在烹饪过程中可与醇类等反应，生成具有特殊风味的酯类；乳酸能适当提高酱油的酸度，赋予其绵长细腻的口感，也是风味物质乳酸乙酯的前体物质；草酸含量过量会危害人体健康，各组草酸含量均在国标范围内[11]。

表2 各组有机酸的含量Table 2 The content of organic acids in each group

由表2可知，各个发酵组中，有机酸含量依次为空白<30 d+C<15 d+C<45 d+C，除了苹果酸和琥珀酸外，45 d+C组有机酸含量最高，45 d+C组有机酸液相色谱图见图4。

图4 45 d+C组有机酸液相色谱图Fig.4 The chromatogram of organic acids in 45 d+C group

2.3 发酵结束后酱油品质的测定

2.3.1 风味物质的检测

通过气质质谱检测到各个发酵组的主要风味物质种类，见表3。发酵结束后各组所产生的风味物质大约有53～73种，其中种类数目最多的是45 d+C组，为73种。在所有风味物质中，构成酱油风味的骨架体系为醇类、酯类和酚类，酯类物质所占比重最大[12]，而有机酸是酯类的前体物质，酯类物质不仅能增强酱油的香味，还能缓和酱油的咸味，对比各发酵组，45 d+C组酵母的酯类物质种类最多，为25种。酱油中的醇类以乙醇为主，它是在耐盐酵母作用下由糖类物质生成的，其中一部分会随温度升高而挥发，一部分会被氧化成酸类，一部分与有机酸及氨基酸生成酯类，残留部分是酱油清爽香气的来源[13]。酚类是酱油香气的重要成分，以烷基酚类为主，但是其含量过高易使人感觉有中药的气味。酱油中醛类物质含量较低，大部分是由氨基酸脱胺基、脱羰基生成，种类有甲醛、乙醛、丙醛、异丁醛、异戊醛等，具有辛辣刺激性气味，微量的醛类可以提高酱油的口感[14]。

表3 各组中的风味物质比较Table 3 The comparison of volatile substances in each group

2.3.2 可溶性无盐固形物含量的测定

衡量高盐稀态酱油品质的一项重要指标是可溶性固形物的含量[15]。由图5可知，发酵结束后各组无盐固形物的含量均在14.00～16.00 g/dL，满足国标(可溶性无盐固形物含量≥13.00 g/dL)规定的高盐稀态一级酱油的标准。其中添加假丝酵母的发酵组均达到了特级酱油(≥15.00 g/dL)的标准，45 d+C组最高，达到15.72 g/dL，其次分别是15 d+C组、30 d+C组。

图5 各组可溶性无盐固形物含量的对比Fig.5 The comparison of content of soluble salt-free solids in each group

3 结论

本研究发现不同时间添加假丝酵母影响HLFSS中酸类物质的含量和种类。在第45天添加假丝酵母后，发酵结束后的总酸、有机酸含量在各组中数值均最大，且经液相检测45 d+C组酸类物质种类最多。通过气质质谱检测风味物质种类以及对可溶性无盐固形物的测定说明45 d+C组的酱油品质最高。假丝酵母通过增加有机酸含量提高HLFSS品质，有机酸含量可作为HLFSS品质评价的依据。在今后的研究中，我们可以研究添加不同种类的耐盐酵母，根据它们各自的优势，为企业实际生产高盐稀态发酵酱油提供更多的理论依据。