不同发酵方式萝卜泡菜中有机酸的变化分析

王芮东，李楠，卫博慧，杜文红

(1.运城学院 理科实验中心，山西 运城 044000；2.运城学院 生命科学系，山西 运城 044000)

萝卜泡菜是以萝卜为原料，添加一定浓度的食盐溶液，通过乳酸发酵而成的一种发酵食品，具有酸脆爽口、风味独特的特点[1-3]，富含膳食纤维、维生素、氨基酸及多种有机酸[4-6]，而有机酸是萝卜泡菜中一种主要呈味物质，其含量的多少与泡菜的发酵程度有直接关系[7-9]。

目前，高效液相色谱法(HPLC)用于泡菜中有机酸的检测研究较少，李志华[10]采用HPLC同时测定泡芥菜、小尖椒、豆角液汁中草酸、酒石酸、乳酸等5种有机酸；叶陵等[11]采用自然、纯菌种两种方式发酵剁辣椒，并对其有机酸的含量进行比较分析。

本试验建立了HPLC法同时测定萝卜泡菜中7种有机酸含量的方法，对采用自然、老泡菜水和乳酸菌制剂3种发酵方式制作的萝卜泡菜在第0～10 d发酵过程中有机酸的变化进行了研究，比较采用不同发酵形式制作的泡菜在发酵过程中各有机酸的变化差异，有助于对泡菜的品质进行科学调控，为泡菜的深入研究提供了有效的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白萝卜、白砂糖、精盐、各种调料：均购自运城市沃尔玛超市。

磷酸二氢钾、磷酸(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；乳酸、柠檬酸、草酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、甲醇(色谱纯)：上海恒远生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；PHS-3C酸度计 上海佑科仪器有限公司；S-1-150S高速离心机 巩义市宏华仪器有限公司；KQ-2200超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制备

1.3.1.1 基本配方

萝卜500 g、水1000 mL、糖50 g、食盐60 g、花椒20 g、干辣椒10 g、大蒜20 g、姜50 g、八角8 g。

1.3.1.2 工艺流程

1.3.1.3 操作要点

原料选择及处理：挑选新鲜、无损害的萝卜，洗净、晾干后，均匀切分成1 cm×1 cm×5 cm大小的萝卜块。

卤水配制：按配方比例在水中加入糖、食盐等辅料，煮沸后冷却备用。

装坛：把萝卜与卤水一同加入泡菜坛中，加水密封。

1.3.1.4 发酵方式

自然发酵：按萝卜与卤水质量比(下同)为1∶2装坛，密封后发酵。

乳酸菌制剂发酵：按萝卜与卤水为1∶2的比例装坛，并按泡菜总质量的0.3%加入乳酸菌制剂。

老泡菜水发酵：按萝卜∶卤水为10∶19的比例装坛，并加入总质量3.5%的老泡菜水。

1.3.2 有机酸测定方法的建立

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；检测器：VWD检测器；检测波长：210 nm；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇为98∶2(磷酸调pH至2.5)；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2.2 有机酸标准溶液制备及标准曲线绘制

称取草酸10 mg、酒石酸40 mg，乳酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸各150 mg，琥珀酸350 mg，用流动相溶解并定容至25 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL草酸，1.6 mg/mL酒石酸，6 mg/mL苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸，14 mg/mL琥珀酸的有机酸混合标准母液，用流动相稀释0，2，5，10，25，50倍经0.45 μm滤膜过滤后进样，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线。

1.3.3 样品的预处理

按发酵萝卜∶汁液为1∶1制取匀浆，称取匀浆5 g加10 mL超纯水，超声处理20 min后9000 r/min离心15 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤后上机检测[12-13]。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0、Excel 2007软件进行数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

由表1可知，7种酸的相关系数均大于0.9971，表明7种有机酸的峰面积与质量浓度的线性关系很好，该条件下可进行泡菜中有机酸的检测。

表1 有机酸标准曲线的线性参数Table 1 The linear parameters of the standard curves of organic acids

2.2 精密度

将稀释10倍的混标连续进样6次，计算其精密度为0.38%～1.67%，表明该法精密度较好，结果见表2。

表2 测定方法的精密度Table 2 The precision of testing methods

2.3 重复性

精密称取乳酸菌制剂发酵泡菜第6天的样品 6 份，按上述色谱条件上机分析，计算其相对标准偏差，其结果为0.53%～7.38%，说明该方法重现性好，结果见表3。

2.4 加标回收率

准确称取乳酸菌制剂发酵第10天的样品6份，将有机酸标准混合液分高、中、低3个梯度(120%、100%、80%)加入样品待测液中，预处理后进行色谱分析，分别计算其加标回收率，加标回收率为92.8%～106.4%，说明该法精确度高，结果见表4。

表4 有机酸加标回收率Table 4 The recovery rates of organic acids

2.5 泡菜中有机酸的分析

2.5.1 HPLC图谱分析

有机酸混合标样及自然、乳酸菌制剂、老泡菜水3种发酵方式第4天泡菜的HPLC图见图 1。

图1 有机酸混合标样(A)及自然(B)、乳酸菌制剂(C)和老泡菜水(D)发酵第4天泡菜的高效液相色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of pickles by organic acid mixed standard sample (A), natural (B), lactic acid bacteria preparation (C) and old pickle water (D) fermentation methods on the 4th day注：1为草酸；2为酒石酸；3为D-苹果酸；4为乳酸；5为乙酸；6为L-苹果酸；7为柠檬酸；8为琥珀酸。

由图1可知，有机酸标准品、泡菜样品中的各有机酸均能很好分离。

2.5.2 泡菜中7种有机酸的分析结果

3种发酵方式第0～10 d的泡菜样品中7种有机酸含量见表5。

表5 3种发酵方式下萝卜泡菜第0～10 d的有机酸含量Table 5 The organic acid content of pickled radish by three fermentation methods at the 0～10th day mg/mL

由表5可知，草酸含量在自然、乳酸菌制剂、老泡菜水3种发酵方式中均呈降低趋势，且在第0～6 d显著下降(p<0.05)，第6天后下降速度趋于平缓，发酵至第10天时分别降至(104.726±0.006)，(108.372±0.023)，(101.187±0.006) mg/mL，均远远低于第0天的(306.815±0.055)，(312.533±0.041)，(287.544±0.111) mg/mL，这是由于萝卜本身含有一定量草酸，发酵过程中会与醇类生成酯类物质[14]。

酒石酸含量在3种发酵方式中均呈先下降后上升趋势，在第0～8 d呈明显下降趋势(p<0.05)，分别由最高值(1.898±0.046)，(1.817±0.077)，(1.825±0.025) mg/mL下降至最低值(0.411±0.004)，(1.003±0.109)，(0.372±0.307) mg/mL后呈显著上升趋势(p<0.05)，且乳酸菌制剂发酵方式的下降幅度明显低于其他两种方式。

柠檬酸含量在自然、乳酸菌制剂发酵方式中呈先下降后上升趋势，第0～4 d分别由(0.611±0.058)，(0.522±0.042) mg/mL降至最低值(0.123±0.026)，(0.127±0.003) mg/mL之后又上升至第10天的最高值(0.689±0.036)，(0.574±0.028) mg/mL，而在老泡菜水发酵中，发酵至第2天后均未检出，这可能与老泡菜水中微生物的代谢有一定关系。

乳酸、乙酸含量在3种发酵方式中均呈上升趋势，乳酸上升速度均高于乙酸。发酵至第10天，乳酸菌制剂发酵中的乳酸含量显著高于其他两种发酵(p<0.05)，分别为(10.147±0.011)，(8.283±0.025)，(5.384±0.285) mg/mL，这是由于乳酸菌制剂发酵中乳酸菌数量较多，通过乳酸菌的生长繁殖会产生更多的乳酸[15]；在第0～10 d的发酵过程中，乳酸菌制剂发酵中的乙酸含量均高于其他两种方式，这是由于乳酸菌制剂发酵中醋酸菌数量多于其他两种方式，通过醋酸发酵会产生较多的醋酸；在乳酸菌制剂发酵中的乳酸含量上升速度明显高于其他两种方式。

琥珀酸含量在3种发酵方式中均呈前期上升后期下降的趋势，自然、乳酸菌发酵方式的变化趋势基本相似，发酵至第4天上升至最高值，分别为(0.727±0.053)，(0.690±0.013) mg/mL，之后又呈下降趋势，而老泡菜水发酵方式发酵至第2天上升至最高值(0.529±0.025) mg/mL后趋于下降，第8天后未检出。

DL-苹果酸含量在3种发酵方式中均呈现波动式的变化趋势，由第0天的(1.582±0.015)，(1.183±0.014)，(1.527±0.026) mg/mL下降至第10天的(1.269±0.025)，(1.159±0.056)，(1.196±0.061) mg/mL。

草酸、乙酸含量在乳酸菌制剂发酵中均显著高于其他两种方式(p<0.05)。

2.5.3 泡菜中有机酸总量的分析

3种发酵方式下萝卜泡菜在第0～10 d的有机酸总量变化见图2。

图2 3种发酵方式下泡菜中有机酸总量的变化Fig.2 The changes in total amount of organic acids in pickles by three fermentation methods

由图2可知，随着发酵的进行，自然、乳酸菌制剂、老泡菜水3种发酵方式有机酸总量均呈下降趋势，分别由第0天的(312.044±0.077)，(316.807±0.070)，(292.193±0.063) mg/mL下降至第10天的(117.665±0.068)，(122.773±0.061)，(108.951±0.143) mg/mL，并且第0～4 d下降趋势明显，第4～6 d下降趋势平缓；发酵过程中，乳酸菌制剂发酵的有机酸总量始终高于其他两种方式。

3 结论

本试验采用高效液相色谱法对自然、老泡菜水和乳酸菌制剂3种发酵方式制作的萝卜泡菜在第0～10 d的7种有机酸进行定性定量分析，得出以下结论：

3种发酵方式中，草酸含量均呈下降趋势，第0～6 d下降变化显著，第6天后下降速度趋于平缓；乳酸、乙酸含量均呈上升趋势，乳酸含量上升速度明显高于乙酸，乳酸菌制剂发酵中乳酸含量的上升速度明显高于其他两种方式，乙酸含量在乳酸菌制剂发酵方式中均高于其他两种方式；酒石酸含量均呈先下降后上升趋势，在第0～8 d下降趋势显著，并且乳酸菌制剂发酵的下降幅度明显低于其他两种方式，第8天后上升趋势显著；琥珀酸含量均呈先上升后下降趋势，自然乳酸菌发酵方式在第4天上升至最高值后开始下降，而老泡菜水发酵方式在第2天上升至最高值后下降，第8天后未检出；柠檬酸含量在自然、乳酸菌制剂发酵方式中呈先下降后上升趋势，而在老泡菜水发酵中，发酵至第2天以后均未检出；DL-苹果酸含量在3种发酵方式中均呈波动式的变化趋势。

7种有机酸总量在3种发酵方式中均呈下降趋势，且第0～4 d下降趋势明显，第4～6 d下降趋势平缓，在整个发酵过程中，乳酸菌制剂发酵方式始终高于自然和老泡菜水的发酵方式。