冻融囊胚移植前HCG宫腔灌注对IVF-ET反复种植失败患者妊娠结局的影响

熊永崂，蔡桂丰，杨桂艳，周雯雯，梁晓燕

(1.珠海市妇幼保健院生殖中心，珠海 519000；2.中山大学附属第六医院生殖中心，广州 510000)

近年来，辅助生殖技术(ART)取得了明显进步，但胚胎种植率低仍然困扰着临床医师和患者，这是IVF-ET成功的最大障碍。胚胎种植失败在IVF-ET失败原因中的占比超过50%[1]。确保胚胎成功种植在子宫内膜上，是IVF-ET成功的关键一步。胚胎种植过程复杂，涉及胚胎与子宫内膜间的分子联系。IVF-ET过程中胚胎种植的影响因素主要涉及子宫内膜容受性、胚胎质量，而宫腔内HCG在其中发挥着重要作用。HCG与内膜的受体结合后可调节子宫内膜的容受性和胚胎种植过程[2]，且该受体广泛存在于子宫内膜的腺体细胞和间质细胞上[3]。目前相关的研究主要集中在第3天胚胎解冻前进行HCG宫腔灌注的研究，未见关于冻融囊胚移植前行宫腔灌注的报道。有研究提示HCG过早暴露可能降低内膜的容受性[4]，在囊胚移植前行HCG宫腔灌注，内膜暴露于HCG时间短，HCG对内膜容受性的影响可能更佳，更有利于囊胚着床。因此，本研究回顾性分析因反复种植失败再次行冻融囊胚移植患者的临床资料，旨在探讨冻融囊胚移植前行HCG宫腔灌注在反复种植失败患者助孕治疗中的效果。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2018年1月至2019年12月在珠海市妇幼保健院生殖中心就诊，因反复种植失败再次行冻融囊胚移植患者的临床资料。纳入标准：3次以上胚胎移植或累计移植超过4枚优质胚胎均未能成功受孕；女方年龄24～40岁。排除标准：合并急性盆腔炎、输卵管积水、各种阴道炎、术前体温超过37.3℃等。

本研究最终纳入160例患者，根据冻融囊胚移植前是否进行HCG宫腔灌注分为灌注组(移植前给予HCG宫腔灌注，n=52)和未灌注组(n=108)。

二、研究方法

1.宫腔灌注方法：宫腔灌注时间在冻融囊胚移植前24 h。常规外阴阴道消毒并铺巾，1 ml注射器连接COOK一次性移植外管，抽吸0.5 ml生理盐水溶解HCG(人绒毛膜促性腺激素，2 000 U/支，珠海丽珠)500 U，缓慢注入宫腔。宫腔灌注后嘱患者卧床30 min，让药物涂布宫腔。

2.内膜准备方案：自然周期方案：月经第10天监测排卵，确定排卵日定义为第1天，排卵后第5天为囊胚移植日；人工周期方案：月经第5天开始口服补佳乐(戊酸雌二醇，拜耳，德国)3 mg，2次/d，根据内膜厚度可调整至4 mg，2次/d。在用药过程中监测内膜厚度，当用药时间达8 d以上，子宫内膜厚度达到7 mm以上肌肉注射黄体酮(黄体酮注射液，浙江仙琚)6 mg，每日一次。肌肉注射黄体酮第6天为囊胚移植日。

3.冻融囊胚移植：所有囊胚均采用玻璃化法进行冷冻和复苏，复苏后的囊胚在培养1～3 h后，进行Gardner评分。在实时B超监测下，将移植外导管沿宫颈外口位置轻轻置入到宫颈内口水平；当外管置入困难，可考虑使用金属内芯协助。将装载有囊胚的内芯导管通过外套管置入宫腔内，距宫底0.5～1.0 cm推注射器注入囊胚。

4.黄体支持和妊娠判断：自然周期黄体支持采用肌肉注射黄体酮20 mg；人工替代周期采用口服补佳乐3～4 mg，2次/d和肌肉注射黄体酮60 mg，黄体支持至移植后8周。囊胚移植后12 d测血清HCG确定妊娠，阳性者移植后23 d行B超检查，若宫内宫外均无孕囊者确定为生化妊娠；B超检查显示孕囊者确定为临床妊娠，并确定妊娠胎数。活产是指孕24周后有活胎分娩，流产是指孕24周之前临床妊娠丢失。

5.观察指标：比较两组患者的年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、FSH、LH、E2、取卵周期数、移植周期数、既往移植胚胎数、内膜厚度、移植囊胚数、生化妊娠率、临床妊娠率、囊胚种植率、流产率、活产率及移植日子宫内膜厚度。

三、统计学方法

结 果

一、患者基本资料

两组患者的年龄、BMI、不孕年限、FSH、LH、E2、取卵周期数、移植周期数、既往移植胚胎数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的基本资料比较(-±s)

二、冻融囊胚移植前内膜准备情况和囊胚移植情况

灌注组内膜准备方案采用人工周期方案和自然周期方案的患者分别是32例和20例，未灌注组采用人工周期方案和自然周期方案的患者分别是64例和44例；两组患者移植日平均子宫内膜厚度及平均移植囊胚数比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

三、两组患者的妊娠结局比较

统计结果显示，灌注组患者的活产率、临床妊娠率、囊胚种植率以及生化妊娠率均显著高于未灌注组(P<0.05)；而两组间流产率比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表2 两组移植日内膜厚度及移植囊胚数比较(-±s)

表3 两组患者的妊娠结局比较(%)

讨 论

控制性促排卵方案、实验室胚胎培养和移植技术的不断优化使得IVF-ET的临床妊娠结局获得了进一步的改善，但是反复种植失败仍然是IVF-ET最大的难题之一[5]。引起胚胎种植失败的原因是多方面的，主要包括宫腔内膜薄、宫腔粘连、子宫内膜炎、内膜与胚胎发育不同步、免疫排斥反应等。通过改善内膜容受性、加强内膜与胚胎同步化以及降低内膜的免疫排斥反应可以有效提高胚胎的种植率[6]。

有文献报道，反复种植失败与母胎界面的免疫失衡相关，即子宫内膜局部存在免疫异常[7]。HCG是胎盘合体滋养细胞分泌的激素，可以促进胚胎的种植。HCG宫腔灌注可以诱导白血病抑制因子、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶P的激活，同时抑制胰岛素样生长因子结合蛋白1和巨细胞集落刺激因子的激活[8]。另外，HCG可以通过调控这些因子通路增加子宫内膜容受性。HCG通过激活基质金属蛋白酶从而加速滋养层细胞对子宫内膜的浸润。内膜容受性增加也提高了不良胚胎的种植，不良胚胎在早期停止发育导致生化妊娠，不会对患者造成明显伤害。细胞免疫在囊胚着床过程中起着重要的作用。HCG能够吸引调节T细胞，保持TH1和TH2效应细胞的平衡，有利于母体-胎儿免疫耐受。此外，HCG还可以增加自然杀伤细胞的数量、抑制巨细胞的迁移来调节母体-胎儿的免疫反应[9]。

HCG是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种二聚体糖蛋白，包含α和β两个亚单位。研究发现HCG宫腔灌注可促进肌动蛋白α2和其编码的α-平滑肌肌动蛋白的表达，提高孕激素受体(PGR)、Ⅰ型雌激素受体(ESRⅠ)、补体C3等子宫内膜容受性相关因子的表达，从而改善内膜容受性[10]。在子宫内膜从增生期转化为分泌期的过程中，HCG促进子宫内膜分泌多种细胞因子。在种植窗期，HCG同样诱导分泌多种细胞因子[4]。另有研究报道，长期暴露在低剂量HCG下的子宫内膜，其细胞外信号调节激酶1和2的磷酸化受阻，可降低细胞外间质的粘合性，改变紧密连接的完整性，提示HCG的过早暴露可能降低内膜的容受性。囊胚移植前行HCG宫腔灌注，内膜暴露于HCG的时间短于冻融第3天胚胎移植前的灌注，此时内膜的容受性更佳，更能提高囊胚的种植率。

既往胚胎移植前HCG宫腔灌注对IVF-ET妊娠结局的影响报道不一[11-12]，且之前研究主要报道冻融第3天胚胎移植前HCG宫腔灌注的临床效果[13]，目前尚未见有关冻融囊胚移植前HCG宫腔灌注对临床结局影响的报道。马荣花等[14]研究发现HCG宫腔灌注可明显提高宫腔灌注组胚胎种植率及临床妊娠率，宫腔灌注组和未行宫腔灌注组两组早期流产率差异无统计学意义。本研究结果提示反复种植失败患者接受HCG宫腔灌注后与未灌注组比有更高的种植率、临床妊娠率及活产率，但流产率组间比较无明显差异，与马荣花等[14]结果一致。另外，本研究中，灌注组患者的生化妊娠率亦明显增加，但生化妊娠对患者无明显副作用。

本研究也存在一些局限性，本研究中HCG的灌注量为500 U，灌注时间为移植前24 h。有研究认为灌注时间为移植前15 min、灌注量为500 U时，患者的种植率、临床妊娠率及活产率最高[15]，但目前关于HCG灌注的时间、灌注剂量尚存在争议，无统一标准。且本研究为回顾性病例研究，存在一些不可避免的干扰因素，如样本的选择偏差、临床医师的经验差异等。因此，有必要对反复种植失败患者囊胚移植前的HCG灌注时间、HCG灌注剂量做进一步大样本的前瞻性随机对照试验进行分析和研究。

综上所述，冻融囊胚移植前HCG宫腔灌注可以明显改善反复种植失败患者的临床结局。同时，冻融囊胚移植前HCG灌注的时间、灌注剂量尚存在争议，后续尚需大样本的随机对照研究深入探讨。