LysR型转录因子 STM0859对鼠伤寒沙门菌环境耐受性的调控作用

马忠梅，宁程程，李 娜，季春晖， 孟庆玲，乔 军，张星星，才学鹏

(1. 石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003； 2. 新疆农垦科学院 畜牧兽医研究所， 新疆石河子 832000；3. 中国农业科学院 兰州兽医研究所，兰州 730046)

鼠伤寒沙门菌(Salmonellaentericasubspecies enterica serovartyphimurium，ST)是一种重要的人兽共患革兰氏阴性致病菌。人和动物感染该菌后，可引起胃肠炎、败血症以及流产等临床症状[1]。ST在世界范围内流行，广泛存在于自然界中[2]，严重危害畜禽养殖业的健康发展[3]。同时，作为一种重要的食源性病原菌，该菌可通过动物性食品感染人类，引起食物中毒，给全球食品安全和公共卫生造成严重威胁[4]。ST可以在低温、高渗、酸性等应激环境下生存，并在一定条件下形成生物被膜来抵抗体内外的不利环境，增强其生存能力[5]。

研究发现，为适应复杂多变的环境，ST需要众多的转录因子来调节特定基因的转录与表达。LysR蛋白家族是在原核生物中发现的一个重要转录因子家族，与细菌群体感应、毒力、生物活性控制、生物被膜形成和细胞分裂等的调控相关[6]。生物信息学分析显示，ST- STM0859蛋白为新型LysR家族转录因子。然而，至今国内外尚未开展ST- STM0859对ST基因转录调控作用的研究。因此，开展ST-STM0859生物学功能研究对于揭示ST基因表达调控的机制具有重要科学 价值。

λ-Red同源重组技术是近年发展起来的一种基因敲除技术，已广泛应用于细菌的基因敲除[7]。为了探究LysR家族转录因子 STM0859对ST环境应激的调控作用，本研究利用λ-Red同源重组技术敲除ST-STM0859基因，并检测分析STM0859基因缺失株对不同胁迫环境的适应能力，探究 STM0859对ST环境应激的调控作用，为揭示 STM0859调控ST基因表达的分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

ST-SL1344强毒株、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、质粒pKD46、pKD3和pCP20由石河子大学预防兽医学实验室保存；TaqDNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T载体、T4DNA Ligase和DNA Marker均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒和质粒小量提取试剂盒均购自天根公司；LB肉汤培养基和SS琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限公司；氨苄青霉素、氯霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、蛋白胨和酵母浸出物均购自英国Oxoid生物有限公司；L-阿拉伯糖购自Sigma公司。

1.2 引物设计

根据GenBank登录的STM0859基因序列(登录号：FQ312003.1)，通过Primer 5.0软件设计以pKD3质粒为模板，5′端含有50 bp的STM0859同源左右臂，3′端与pKD3质粒上氯霉素抗性基因同源互补的引物R1和R2；检测pKD46的特异性引物R3和R4；pCP20验证引物R5和R6；缺失株构建后验证及测序引物R7和R8；引物均由北京华大基因生物公司合成(表 1)。

表1 构建 STM0859基因缺失株的特异性引物Table 1 Specific primers for construction of STM0859 gene deletion strain of ST

1.3 打靶基因的扩增

以pKD3为模板，R1/R2为引物，扩增用于敲除STM0859基因的打靶片段。PCR反应体系如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，67 ℃退火50 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，并与pMD19-T(simple)载体连接，转化至DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，测序验证。

1.4 ST-SL1344感受态细胞的制备及pKD46质粒的电转化

挑取ST-SL1344单菌落接种于20 mL LB液体培养基，置于37 ℃，180 r/min过夜培养。以1∶100转接入LB培养基，使OD600达到 0.4～0.6，制备感受态细胞。提取pKD46质粒，电转化至ST-SL1344感受态细胞，挑取阳性转化子PCR鉴定，作为同源重组的宿主菌。

1.5 打靶片段的电转化

制备SL1344-pKD46感受态细胞，将打靶片段转化至SL1344-pKD46感受态细胞。电转完成后迅速加入42 ℃预热的1 mL SOC培养基，轻轻吹打混匀后置于37 ℃，180 r/min振荡培养2 h，取200 μL菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板(Amp质量浓度为100 ng/mL，Cm质量浓度为34 ng/mL)，37 ℃恒温培养，PCR鉴定并筛选阳性转化子。

1.6 ST- △STM0859缺失株的构建与鉴定

制备消除pKD46质粒的重组菌ST-△STM0859cat感受态细胞，电转化pCP20质粒，将转化后的菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，置于30 ℃恒温培养箱过夜培养。PCR鉴定阳性克隆，得到ST-△ STM0859缺失株并进行测序验证。

1.7 ST- △STM0859缺失株对环境应激适应能力的测定

挑取ST-SL1344和ST-△STM0859单菌落分别接种于BHI液体培养基中，37 ℃过夜培养，调整菌液浓度使初始菌的OD600≈0.055，于 37 ℃，180 r/min条件下振荡培养，每隔1 h取200 μL菌液测OD600值，连续测定12 h，观察其生长速度。以1∶100的比例分别接种于50 mL pH为4、10和含有4%NaCl(%为质量体积比)、0.1%H2O(体积分数)和3%乙醇(体积分数)的BHI液体培养基中，置于37 ℃，180 r/min振荡培养；每间隔1 h测其OD600值，绘制生长曲线，观察 STM0859基因缺失对ST在不同胁迫环境条件下生长特性的影响。

1.8 STM0859缺失对ST运动能力的影响

挑取ST-SL1344和ST-△ STM0859单菌落分别接种于BHI液体培养基中，37 ℃过夜培养，将OD600值调至1.0，吸取1 μL菌液点样于LB及pH为4、5和6的0.3%半固体培养基(质量体积比)，置于37 ℃静止培养16 h。通过测量在平板中迁移形成圆圈直径的大小分析不同pH对其运动能力的影响。

2 结果与分析

2.1 打靶基因的扩增与pKD46质粒的电转化

以pKD3为模板，R1/R2为引物扩增大小为1 198 bp的打靶片段，扩增产物含有STM0859基因上下游同源臂和Cm抗性基因，条带大小与预期一致(图 1-a)。用特异性引物R3/R4对阳性转化子进行PCR验证，片段大小为1 127 bp，与预期值大小一致(图 1-b)，测序结果证实pKD46质粒电转成功。

2.2 缺失株ST- △ STM0859 的鉴定

将pCP20质粒电转至1344△ STM0859cat感受态细胞，用R5/R6引物进行PCR验证(图2-a)。用检测引物R7/R8对野生株ST-SL1344和ST-△ STM0859cat携带pCP20质粒的阳性转化子进行PCR验证，野生株扩增出1 146 bp的片段，ST-△ STM0859cat扩增出220 bp 片段(图 2-b)。测序结果也进一步证实成功构建ST-△ STM0859基因缺失株。

2.3 ST- △ STM0859 对不同应激环境的适应能力

生长曲线如图 3所示，以第12小时为时间点做差异分析，与亲本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株生长能力与亲本株基本一致；在4%NaCl、0.1%H2O2、3%乙醇及pH=10的胁迫环境中二者生长速度差异不显著；但在pH=4的酸性应激中适应能力显著下降，差异极显著(P<0.01)。表明STM0859参与ST对酸应激环境耐受的调控过程。

2.4 ST- △ STM0859 在不同pH半固体中的运动能力

运动能力检测结果显示，与亲本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株在LB及pH为6的半固体中运动能力差异不显著；但在pH为4时，ST-△ STM0859缺失株运动能力降低(图 4)，与亲本株相比差异极显著(P<0.01)(图 5)；提示 STM0859参与对ST在酸性环境下运动能力的调控。

3 讨 论

ST在自然界生存过程中，已经进化出多种对抗不利环境的应激策略[8]，并利用多种转录调控因子在转录水平上调节其生存必需基因(如毒素，黏附素和菌毛)的表达，以达到适应不同应激环境的目的[9]。ST作为一种重要的消化道致病菌，可在胃中低pH环境中生存，并侵入肠上皮细胞引起机体感染。ST被内化后，对细胞中吞噬溶酶体中的低pH内环境产生抵抗作用，并在巨噬细胞中生存和繁殖[10]。因此，感知和响应pH变化对于ST的生存至关重要。有研究报道，ST可在不同生长环境中活化多个低pH诱导的存活系统，在对数期和固定期发生的诱导型耐受反应可以产生不同的酸性休克蛋白，以防止和修复大分子在极端酸性条件下受损[11]。此外，有研究发现，在ST上还存在另一种pH形成稳态的耐酸调控机制，即氨基酸脱羧酶系统，能在一定条件下抵抗直接的酸胁迫。

LysR型转录调节子是寡聚细菌转录因子的不同家族，遗传进化分析显示该因子在ST菌株间核苷酸序列上具有同源性和保守性的DNA结合域，可与靶基因的启动子区域结合，调控靶基因的表达[12]。LysR型转录调节因子是目前发现的重要转录因子调节家族，广泛存在于大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌，根瘤菌和阴沟肠杆菌等中。已有的研究显示，LysR家族在细菌不同的生长环境中表达差异显著，参与调控细菌的代谢、群体感应、毒力、运动性、氧化应激反应、毒素产生等[13]。研究肺炎克雷伯菌LysR转录因子oxyRKP时发现，oxyRKP参与调控该菌的氧化应激反应、最低抑菌浓度及毒力等[14]。鼠伤寒沙门菌LysR转录因子OxyR、SpvR、LeuO、CysB参与了氧化应激、细菌严谨反应、半胱氨酸生物合成、毒力因子合成等[15]。Chen等[16]发现恶臭假单胞菌LysR转录因子pnpR正调节自身的表达和pnpC1C2DECX1X2操纵子的表达；然而其在碳源利用中发挥负调节作用。Fu等[17]发现，在嗜水链球菌中，LysR转录因子参与了其耐药性的调节。提示LysR型转录因子对细菌不同基因的表达发挥不同的调控作用。STM0859蛋白属于ST -LysR家族转录因子，其蛋白二级结构含有1个DNA底物结合域和1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH-18结构域。序列比较发现，其N端含有1个H-T-H超二级结构域，C端具有1个PBP2配体结合域，与大肠杆菌和不动杆菌LysR家族转录调控因子相似。

本研究在前期研究的基础上，利用λ-Red同源重组技术成功构建ST-△ STM0859缺失株，检测分析ST-△ STM0859在不同胁迫环境下的生长情况。与亲本株相比，在pH为4的酸性环境下，ST-△ STM0859的生长及运动能力明显降低(P<0.01)，表明ST- STM0859参与ST对酸应激的适应性调控，为深入揭示ST-STM0859介导酸调控的分子机制奠定研究基础。