基于GC-MS 技术对钩吻碱食物中毒的应急检测

◎ 冯 涛，陶 森，阮世勇，黎 献，林对俭

（阳江市检测检验中心，广东 阳江 529500）

钩吻（Geisemium elegans）是马钱科（Loganiaceae）葫蔓藤属（Geisemium）植物[1]，为有毒中药，古人形容其毒性猛烈“入口即钩人喉吻”，故取名“钩吻”，又称“断肠草”“大茶药”，主要分布在东南亚国家和我国的南部地区（如福建、广东、广西等地）。钩吻花、叶、根、茎均有剧毒，根部毒性最强。作为带毒中药多外用以治疗皮肤病、风湿、消肿止痛[2]。钩吻药性和毒性均来自于钩吻碱，研究表明钩吻碱具有抗肿瘤、抗焦虑、消炎镇痛、促食欲的作用[3]，对肝脏、肾脏、睾丸和神经中枢系统都有严重的毒性作用，能透过血脑屏障，在脑中的消除速度相对较慢，具有很强的神经毒性[4]。中毒症状主要为口渴、流涎、恶心、呕吐、抽搐、肌肉无力、四肢麻木、烦躁不安、心律失常、头晕和呼吸困难等[5]。钩吻药用起效剂量同中毒剂量相近[6]，常因误食及使用不当引起中毒事件。而广东阳江民间有使用钩吻根煲汤的饮食习惯，时有剂量掌握不当造成食物中毒，是该地区的高风险食物中毒因子，近5 年来已发生4 起钩吻碱中毒事件。因此，在该区域研究和开展钩吻碱应急检测工作极为必要，对保障该区域食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

岛津GCMS-TQ8050 气相色谱串联三级四极杆质谱联用仪（配备EI 源，日本Shimadzu 公司）； KQ-250DV 超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；MS3 型漩涡振荡器（德国IKA 公司）；sigma3-18ks高速冷冻离心机（德国sigma 公司）；TruboVap Ⅱ型吹氮浓缩仪（美国Caliper 公司）；0.22 μm 有机系针筒式微孔滤膜过滤器（上海ANPLE 公司）。

1.1.2 试剂

丙酮、正己烷（色谱纯，德国Merck 公司）；氢氧化钠和无水硫酸钠为分析纯；标准品钩吻碱（纯度99.0%），分子式C20H22N2O2，分子量322，美国Sigma 公司。

样品：患者血液1、患者血液2、洗胃液1、洗胃液2、呕吐物1 及患者家中采集的未食用完的食物：钩吻根猪脚汤、白切鸡、烧鹅、炒白菜、炒菜心，共计10 份。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

将钩吻碱标准物质配制成质量浓度为100 mg·L-1的标准储备液，-20 ℃下保存。临用前使用三氯甲烷梯度稀释，配成质量浓度分别为0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1标准溶液。

1.2.2 样品前处理

分别取5.00 g 样品，各加入10 mL10%NaOH，超声振荡提取10 min，4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，加入5 mL 正己烷，振荡5 min 进行液液萃取，4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤备用。

1.2.3 仪器条件

色谱条件：进样口温度200 ℃；进样量：1 μL，色谱柱为Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×100 mm，0.25 μm， 日本Shimadzu 公司），初始柱温100 ℃，保持1 min， 以40 ℃ ·min-1升至280 ℃，保持 10 min；载气为氦气，恒定流速：1.2 L·min-1，不分流进样模式。

质谱条件：接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；电压70 eV；采集时间2 ～25 min；全扫描模式（Scan）扫描范围50 ～350 amu；选择离子模式（SIM）采集特征碎片离子（m/z）108、279、322、251。

1.2.4 定性定量方式

采用气相色谱-串联质谱在Scan 模式下对样品全扫描，所得数据使用Nist17 谱库检索定性；SIM 模式下依次测定标准溶液和样品测试液，通过比较各特征碎片离子的丰度来进一步确证。钩吻碱标准品各特征离子碎片丰度分别为：108（100%）、279（42%）、322（35%）、251（18%），并要求试样中各离子的丰度不得超过标准的±20%。没有标准物质时，可直接用谱库检索结果定性。

采用外标法定量，选择m/z108 为定量离子[7]，以标准系列浓度为横坐标，标准定量离子峰面积为纵坐标制作校正曲线，待测目标化合物定量离子峰面积与相应校正曲线比较定量，应急检测中有时也采用单点外标法定量。

2 结果与分析

2.1 谱库检索结果

样品在Scan 模式进行全扫描，发现钩吻根猪脚汤、呕吐物1、洗胃液1 三种样品中有可疑峰，出峰时间为10.25 min，钩吻根猪脚汤中峰面积最大，该可疑检测数据进行Nist17 谱库检索，在汤和患者呕吐物中发现钩吻碱（相似度98%），钩吻根猪脚汤样品（图1）中出现的4 个明显的峰，依次命名为1 号～4 号峰，经Nist17 谱库检索，3 号峰（图2）为钩吻碱，其他为香料物质等。

图1 钩吻根猪脚汤ScanTIC 图

图2 3 号峰Scan 质谱图

在SIM 模 式（图3）下 以m/z108、279、322、251 为监测离子，依次进样钩吻碱标准物质和阳性样品，进行二级离子确证，其出峰时间一致、离子丰度比一致，结合谱库检索结果及临床症状可以确认钩吻碱为本起食物中毒事件的中毒因子。SIM 模式仅监测选定目标离子，能更好地排除基质和杂质的干扰。

图3 样品和标准品谱图对比图

2.2 定量结果

在SIM 模 式 下 以m/z 108、279、322、251 为 监测离子，m/z108 为定量离子，依次进样0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的 钩吻碱标准物质，以浓度为横坐标峰面积为纵坐标进行一次线性拟合，绘制标准曲线，一次线性方程为：Y=106 808.5X+12 421.96，R2=0.999 8；线性良好；满足定量要求。在相同仪器条件下对样品进行测定，使用LabSolution 数据处理系统对检测结果处理。样品定量结果见表1。患者呕吐物、洗胃液、钩吻根猪脚汤中均检出钩吻碱，其中钩吻根猪脚汤中含量最高为6.780 mg·kg-1，而钩吻碱大鼠腹腔注射半数致死剂量（LD50）为1.2 mg·kg-1[8]，汤中的钩吻碱含量远超中毒剂量，可以判定患者是食用了钩吻猪脚汤导致的钩吻碱中毒。钩吻碱毒性强，致死剂量低，中毒病亡率高达47.6%。有报道称钩吻根3 g 左右、嫩芽7 个、流浸膏3.5 ～5.0 mL 或钩吻碱0.15 ～0.30 g 即可致死。

表1 GC-MS 检测结果表

3 讨论与结论

目前，钩吻碱检测方法有气相色谱法（GC）[9-10]、 高效液相色谱法（HPLC）[11-12]、气相色谱- 质谱联用法（GC-MS）[13]、高效液相色谱-质谱联用法 （HPLC-MS/MS）[14-15]。GC、HPLC 灵敏度低、仅依据保留时间定性，需要标准物质做参比，遇到结构相似的物质难以分离、定性能力弱不适用于食物中毒的应急检测；LC-MS/MS 有较高的灵敏度、准确的定性能力和高速的分析效率是钩吻碱常见的检测方法，但三重四级杆质谱仪不能配制标准谱库，不具备未知检测目标的检索能力，定性能力对标准品依赖较高，在应急检测工作中具有很大的局限性。GC-MS 分析效率、灵敏度、准确度同LC-MS/MS 相当，可配备Nist 17 质谱库（210 000 余种化合物，240 000 余张谱图）和Wiley 质谱库（300 000 余种化合物，400 000 余张谱图）[16]，等多种标准谱库，基本涵盖了常见挥发性毒物，可进行谱库检索定性，二级质谱图确证，具有无需标准品即可定性和定性准确的优势，适合食物中毒应急检测的需要。钩吻碱本身是碱性物质根据相似相溶原理，碱性溶液提取率较高，报道中多使用碱性溶液浸提、醇溶液提取、或酸性溶液提取后调节pH至碱性后采用有机溶剂提取[17-18]。水作为提取溶剂低廉、无毒、易得，但提取效率低，提取液不能直接用于GC-MS 测定；酸可以和生物碱反应形成盐，同时沉淀酸不溶性物质，但由于盐的特性提取纯度不高，且不易分离；生物碱多可溶于醇和三氯甲烷，且三氯甲烷提取效率较高，考虑氯仿直接提取时杂质含量较高，一般采取先使用碱性溶液提取，再使用三氯甲烷萃取的方法。考虑到应急检测的时效性和GC-MS特性，本次应急检测使用10%NaOH 溶液提取，三氯甲烷液液萃取，过0.22 μm 微孔滤膜后，使用气质Scan 模式全扫描Nist17 谱库检索定性，比对标准物质全扫描质谱图进行确证，使用SIM 模式进行定量，该方法前处理过程简单高效，定性定量准确。GC-MS 作为精密贵重仪器，多配备在市级以上实验室，而钩吻碱中毒事件多发于欠发达山区，若当地检测机构可能未配备这类仪器设备， 可利用相对简易的仪器开展钩吻碱中毒的定性实验，如薄层色谱（TLC）法[19-20]、特异显色反应法[21]等也能在此类应急检测中发挥相应作用。

气质联用仪SIM 模式下的选择性离子扫描有效降低复杂基质对检测结果的干扰，对样本的净化程度依赖低，有效缩短前处理时间。Scan 模式下可通过标准谱库检索实现危害因子的精准识别，定性能力不依赖标准品。应用于中毒样品中钩吻碱的检测具有高效准确的特性，能应对食物中毒的突发性和检测目标的不确定性，满足应急检测速度快、灵敏度高、准确度高的要求。