扶肾方对尿毒症腹膜透析大鼠腹膜功能及VEGF、TNF-α、IL-12、IFN-γ 的影响

杨 波王孟孟孙 林李 洁乔延恒杨洪涛*

(1.天津中医药大学第一附属医院肾病科,天津 300381； 2.安徽省阜阳市第四人民医院内分泌科,安徽 阜阳 236021)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)作为主要的肾替代治疗方法之一,极大的提高了终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)患者的生存质量。但是由于患者长期使用生物不相容性的腹膜透析液,腹膜的超滤功能逐渐减退,终致超滤衰竭,将迫使患者退出腹膜透析治疗[1]。 研究表明,腹膜血管新生是导致超滤衰竭的主要原因之一[2]。 因此,采取有效策略抑制腹膜血管新生,维持腹膜有效超滤是保证PD 患者长期存活的关键。 中药复方因其多靶点调节的特点,在抑制腹膜血管新生方面面具有较好前景[3], 扶肾方(院内制剂: 津药制字Z20130941)由生黄芪、当归、陈皮、半夏、丹参、鬼箭羽、熟军、仙灵脾组方,具有健脾益肾、通腑降浊的功效。 本研究利用5/6 肾切除尿毒症大鼠PD 模型,模拟人体内PD 过程,观察扶肾方对尿毒症大鼠腹膜形态、腹膜功能及腹膜组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-12(interleukin-12,IL-12-)及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的影响,为扶肾方防治PD 超滤衰竭提供新的思路与方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性SPF 级SD 大鼠50 只,鼠龄6 ～8 周,体重200～250 g,购自北京维通利华实验技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 饲养于天津中医药大学动物房内[SYXK(津)2018-0002]。 本研究经天津中医药大学动物实验伦理委员会批准(TCMLAEC2019067),在整个实验过程中依照“3R”原则给予实验动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

1.5%及4.25%双联腹膜透析液,广州百特医疗用品有限公司；扶肾方饮片购于天津中医药大学第一附属医院；塞来昔布(批号:J20140072),美国辉瑞制药有限公司；尿素氮(BUN)(C013-2)和肌酐(Cr)(C011-2)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HE 染色试剂盒(G1120)购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖检测试剂盒购自上海荣盛生物医药有限公司；液相芯片试剂盒(RECYTMAG-56K)购自美国MILLIPORE 公司。 Luminex 200 液相芯片分析仪(美国Luminex 公司)；紫外可见分光光度计(T6 新世纪),北京普析通用仪器有限责任公司；-80℃超低温冰箱(BCD-215KS),青岛海尔股份有限公司；7100 型日立全自动生化分析仪购自日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

50 只SD 大鼠常规饲养,适应环境1 周后,按随机数字表法随机分为正常对照组(Control)、模型组(Model)、扶肾方低剂量组(FSF-L)、扶肾方高剂量组(FSF-H)、塞来昔布组(Cel),每组10 只。

1.3.2 扶肾方制备

扶肾方组成:陈皮10 g、半夏15 g、黄芪15 g、当归10 g、仙灵脾15 g、丹参30 g、熟军10 g、鬼箭羽30g。 扶肾方以中药饮片为原料,经过提取、分离、浓缩、干燥、制粒而成。 按照药物人和大鼠体表面积计算方法,折算系数为0.018。 扶肾方颗粒成人服用剂量为每次18 g,按照折算系数计算出大鼠等效剂量为0.324 g,每日2 次。

1.3.3 动物造模与给药

正常对照组大鼠不进行任何处理,其余各组大鼠行5/6 肾切除术,术后1 周检测肾功能。 各组肾功能达标后,腹腔注射1.5%腹膜透析液,按每日100 mL/kg,以大鼠右下腹靠近腹股沟中点为穿刺注射部位,各组所注射液体均腹腔内保留,不抽出。模型组在规律腹腔注射腹膜透析液同时每日生理盐水2 mL 灌胃,连续4 周；扶肾方低剂量组在规律腹腔注射腹膜透析液同时每日扶肾方324 mg/mL,2 mL/d 灌胃,连续4 周；扶肾方高剂量组在规律腹腔注射腹膜透析液同时每日扶肾方648 mg/mL,2 mL/d 灌胃,连续4 周；塞来昔布组在规律腹腔注射腹膜透析液同时每日塞来昔布溶液1.8 mg/mL,每天灌胃2 mL,连续4 周；正常对照组予每日生理盐水2 mL 灌胃,连续4 周。

1.3.4 大鼠血清肌酐和尿素氮水平的检测

在右肾切除术后第4 周从大鼠眶后静脉丛取血,低温高速离心机3500 r/min 离心10 min,留取上清液,应用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐和尿素氮的水平。

1.3.5 各组大鼠腹膜组织HE 染色

取大鼠壁层腹膜组织,常规固定、脱水、石蜡包埋、切片后,行苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察大鼠腹膜形态学变化。

1.3.6 各组大鼠腹膜功能检测

行腹膜平衡实验,检测大鼠腹膜转运功能,方法:各组大鼠杀检前,每只大鼠腹腔注射4.25%腹膜透析液25 mL,4 h 后麻醉大鼠,抽取腹腔液体量,打开腹腔,将干纱布消毒,称重后置入腹腔,以吸取未抽净的腹透液,后再称取纱布质量。 同时分别留取腹透液标本,1500 r/min 离心5 min,留取上清液,紫外分光光度计检测每组腹膜透析液的葡萄糖浓度,根据检测结果计算超滤量和葡萄糖转运量。 超滤量=(纱布吸水后的质量-纱布的质量)× 1 mL/g+引流量-腹腔注射量；葡萄糖转运量(mmol/kg)=(透析液初始葡萄糖浓度×注入透析液体积)-(透析末葡萄糖浓度×终末透析液出量)。

1.3.7 大鼠腹膜组织VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ含量检测

适量腹膜组织进行匀浆后,取上清液,采用Luminex200 液相芯片分析仪进行VEGF、TNF-α、IL-12、IFN-γ 检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。 符合正态分布的计量资料用平均数±标准差(±s)表示,不符合正态分布的资料用中位数(四分位数间距)表示,多组比较采用单因素方差分析,以Levene 法进行方差齐性检验,若方差齐,采用LSD-t法,若方差不齐,采用Games-Howell 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立大鼠尿毒症模型

尿毒症组大鼠血清肌酐和尿素氮浓度为正常对照组的2 ～3 倍,表明大鼠尿毒症模型造模成功[4-5]。 见表1。

2.2 各组大鼠腹膜组织HE 染色

正常对照组大鼠腹膜组织较连续和完整,腹膜间皮细胞呈扁平状态,模型组腹膜组织明显增厚,部分呈柱形,还可见到间皮细胞的脱落,炎细胞浸润等病理变化。 扶肾方及塞来昔布干预后,炎性细胞浸润、腹膜增厚较模型组减轻。 见图1。

2.3 各组大鼠腹膜功能

腹膜平衡实验结果,与正常对照组比较,模型组、扶肾方低剂量组、扶肾方高剂量组及塞来昔布组超滤量均明显下降,模型组、扶肾方低剂量组葡萄糖转运量均增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较,扶肾方高剂量组超滤量明显增加,扶肾方高剂量组及塞来昔布组葡萄糖转运量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。 见表2。

2.4 扶肾方对各组大鼠腹膜组织VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影响

与正常对照组比较,模型组大鼠腹膜组织VEGF、TNF-α 表达上调,IL-12、IFN-γ 的表达下调,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。 与模型组比较,扶肾方低剂量组VEGF、TNF-α 表达下调,IL-12、IFN-γ 表达上调,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)；扶肾方高剂量组和塞来昔布组VEGF 表达下调,IL-12、IFN-γ 表达上调,差异具有统计学意义(P＜0.01)。 见表3。

表1 正常对照组与尿毒症组大鼠肾功能比较Table 1 Comparison of renal function between normal control group and uremic group rats

注:A:正常对照组；B:模型组；C:扶肾方低剂量组；D:扶肾方高剂量组；E:塞来昔布组。图1 各组大鼠腹膜组织HE 染色Note. A, Control group. B, Model group. C, FSF-L group. D,FSF-H group. E, Cel group.Figure 1 HE staining of peritoneal tissues of rats in each group

表2 各组大鼠超滤量、葡萄糖转运量的变化Table 2 Changes in ultrafiltration volume and glucose transport of rats in each group

3 讨论

腹膜透析是终末期肾病患者肾替代治疗的主要方式之一,但PD 相关的腹膜超滤衰竭是长程PD患者面临的严峻问题。 其中腹膜血管新生是引起超滤衰竭的重要原因,新生的腹膜血管增加了腹膜毛细血管交换面积,造成小分子溶质高转运,葡萄糖快速被腹膜吸收,腹腔的渗透浓度梯度快速消失,从而出现腹膜超滤减少,患者体内水分和尿毒素不能有效清除,极易出现心脏超负荷,终致患者退出PD,甚则危及生命。 有研究表明[6],抑制腹膜血管新生,有助于减少腹膜粘连、延缓腹膜纤维化进程,其保护腹膜功能的作用比抑制腹膜纤维化更强。 腹膜血管新生发生的原因和机制复杂,受非生物相容性腹透液和炎症状态等因素影响。 现代医学主要采用改善腹透液生物相容性、预防腹膜炎等手段抑制腹膜血管新生,防治腹膜超滤衰竭。 部分单味及复方中药中药具有抑制腹膜血管新生、抗腹膜纤维化的作用,中医药减轻腹膜血管新生,防治腹膜超滤衰竭备受研究者的关注。 研究表明,黄芪甲苷、丹参酮、大黄素、肾康注射液等可改善由高糖腹透液诱导的大鼠腹膜功能减退,防治腹膜纤维化[7]。

Hanahan 等[8]在上世纪九十年代提出了血管生成与血管生成促进因子和血管生成抑制因子的表达有关,也就是有关血管生成的开关平衡假说,即血管稳态的维持,需要血管生成促进因子和抑制因子的共同调控,若两种因子的表达失衡,就可能诱发血管新生化,引起病理性的血管新生。 VEGF 是内皮细胞最具特异性的生长因子,主要功能是诱导内皮细胞增殖、分化和迁移,是血管新生的标志性指标[9]。 有研究表明[10],在尿毒症和高糖腹透液的刺激下,腹膜组织高表达血管生成促进因子VEGF,并和腹膜血管新生程度呈正相关；应用血管生成抑制剂可使VEGF 表达下调,减轻腹膜血管新生。TNF-α 是由一种活化的单核细胞、巨噬细胞合成和分泌的、最重要的炎症因子之一。 研究发现TNF-α可以促进血管内皮细胞的增殖,与VEGF 同样都具有促进血管生成的作用[11-12],IL-12 是由抗原提呈细胞和B 细胞产生,是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子,并以这种形式分泌到细胞外。 IL-12 能诱导IFN-γ 产生,在体内免疫应答中它也是IFN-γ产生所必需。 研究表明,IL-12 与IFN-γ 都具有抑制血管生成的作用,IL-12 与IFN-γ 表达上调,能够减少VEGF 的生成,发挥抑制血管新生的作用[13-14]。塞来昔布是一种环氧化酶-2 抑制剂,可特异性抑制环氧化酶-2,减少VEGF 的生成,从而抑制腹膜血管新生,目前在实验研究中得到广泛应用[15-16]。 笔者课题组前期研究发现,扶肾方可通过调节尿毒症腹膜透析大鼠腹膜组织TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表达抑制腹膜间皮细胞EMT,改善腹膜纤维化及腹膜超滤功能[17]。

本研究采用大鼠5/6 肾切除建立尿毒症模型后,进行腹腔注射腹膜透析液,成功复制尿毒症腹膜透析大鼠模型,并观察了扶肾方对尿毒症腹膜透析大鼠腹膜组织的形态学、腹膜的超滤功能及葡萄糖转运功能,以及腹膜组织血管生成促进因子和血管生成抑制因子VEGF、TNF-α、IL-12、INF-γ 表达的影响。 研究显示,模型组腹膜组织明显增厚,部分呈柱形,还可见到间皮细胞的脱落,炎细胞浸润等病理变化。 扶肾方及塞来昔布干预后,炎性细胞浸润、腹膜增厚较模型组减轻。 腹膜平衡实验结果表明,与模型组比较,扶肾方高剂量组超滤量明显增加,扶肾方高剂量组及塞来昔布组葡萄糖转运量明显下降,差异有统计学意义。 与正常对照组比较,尿毒症腹膜透析模型组大鼠腹膜组织中VEGF、TNF-α 的表达明显上调,IL-12、IFN-γ 的表达明显下调；与模型组比较,扶肾方低剂量组、扶肾方高剂量组和塞来昔布组均能下调VEGF、TNF-α 表达,上调IL-12、IFN-γ 的表达。 扶肾方的作用与塞来昔布类似。 笔者推测在5/6 肾切除大鼠尿毒症腹膜透析模型中,扶肾方可改善腹膜组织形态学变化,并通过下调腹膜组织中血管生成促进因子VEGF、TNF-α的表达,上调血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表达,达到改善腹膜功能,防治超滤衰竭的作用。

中医学认为,本虚标实为尿毒症的基本病机,本虚主要为脾肾亏虚,标实表现为湿浊、瘀血,浊、瘀主要由脾肾亏虚导致。 患者行PD 治疗后,仍不失尿毒症病机关键,故脾肾亏虚、湿浊瘀血内蕴为PD 相关腹膜超滤衰竭的主要病机。 扶肾方是根据以上病机关键而组成的临床效方,由黄芪、当归、陈皮、半夏、淫羊藿、熟军、丹参、鬼箭羽组成,主要功效为“健脾益肾,化瘀降浊”,组方融中医“补、和、消”三法于一体,前期临床及基础研究表明,该方能显著改善尿毒症PD 大鼠肾功能,延缓PD 腹膜纤维化,改善腹膜超滤衰竭[17-18],但其具体作用机制尚不明确。

表3 扶肾方对各组大鼠腹膜组织VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影响Table 3 Effect of FSF on VEGF, TNF-α, IL-12 and IFN-γ contents in peritoneal tissue of rats in each group

综上所述,本研究从动物实验初步证实,扶肾方具有减轻尿毒症腹膜透析大鼠腹膜损伤、改善腹膜超滤衰竭的作用,该作用可能与下调腹膜组织血管生成促进因子VEGF、TNF-α 的表达,上调血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表达有关,但扶肾方调控腹膜血管新生的具体作用机制还需进一步深入探索。