基质金属蛋白酶-2、CD34标记微血管密度在胆囊癌组织中的表达及临床意义

买赛虎，徐建庆，张站产

(西安高新医院普外科，陕西 西安710075)

胆囊癌(Gallbladder carcinoma,GC)是胆道系统最常见的恶性肿瘤，占消化系统恶性肿瘤发病率的第五位，其发病比较隐匿，侵袭性强，早期临床表现缺乏特异性，一旦出现临床体征多为中晚期[1-2]。现在一致的认识细胞外基质(Extracellular ma-trix,ECM)被降解引起细胞基底膜的完整性破坏是肿瘤浸润正常组织开始转移的先决条件[3]。CD34是唾液酸表面分子家族中的一员，对皮内细胞的黏附作用有极其重要的意义，此过程是形成新生血管的关键步骤。肿瘤周围血管密度可反映出肿瘤生成血管的能力，微血管密度(Microvessel density，MVD)是反映血管生成能力的重要指标之一，肿瘤的生长、浸润、转移与MVD有着关系密切[3]。采用CD34标记 MVD (CD34-MVD)可以提供清晰的判断依据，密度越大组织中的新生血管数量越多，同时由于新生血管性质的不稳定性，通常情况下会呈出现扭曲、扩张和不均匀的状态，胆囊癌患者CD34-MVD值在这种高密度状态下，最容易发生肿瘤扩大和转移情况[4]。基质金属蛋白酶(Matrixmetalproteinases，MMPs)是降解细胞外基质重要酶类之一，可以降解细胞外基质中的多种蛋白成分和细胞基底膜，从而促进肿瘤细胞在局部和远处组织发生侵袭和转移，与肿瘤的侵袭、转移关系密切[5]。基质金属蛋白酶-2(Matrixmetallopro-teinases-2，MMP-2)是其家族的重要成员之一，进一步研究发现其可作为肿瘤侵袭、转移的标志物，并且认为MMP-2与恶性肿瘤的浸润转移密切相关[6]。本研究探讨MMP-2及CD34-MVD在胆囊癌中的表达水平及两者的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究的所有病例选自高新医院2014年5月至2019年5月手术切除标本，术后病理证实，共77例，胆囊癌52例，女35例，男17例，年龄51～72岁，中位数年龄62.6岁。组织学分型：高分化腺癌15例，中分化腺癌13例，低分化腺癌24例，无淋巴结转移22例，淋巴结转移30例。Ⅰ期5例：Ⅱ期8例；Ⅲ期17例；Ⅳ期22例。慢性胆囊炎25例，女17例，男8例，年龄45～63岁，中位数年龄55.6岁。

1.2 研究方法 使用免疫组织化学法对胆囊癌及慢性胆囊炎患者中的MMP-2、CD34-MVD表达情况进行检测，依照SABC试剂盒说明进行。取石蜡标本进行脱蜡、抗原修复，添加一抗，4 ℃冰箱过夜，添加生物素化二抗，持续30 min。使用DAB进行室温显色，显微镜下观察控制显色，充分显色后蒸馏水冲洗。在光镜下进行病理学诊断，按照肿瘤细胞的分化程度分为低、中、高分化三组。对于阴性对照组：采用PBS液取代一抗作为阴性对照，其余实验步骤同前。

1.3 结果判定 细胞膜和细胞浆内呈现棕黄色颗粒为CD34-MVD蛋白表达阳性。MMP-2表达阳性表现在细胞质内，呈现棕黄色或棕褐色颗粒；根据相关文献[3]，以显色强度和范围分为：强阳性()，阳性细胞数>50%；中等阳性()，阳性细胞数占25%～50%；弱阳性(+)，阳性细胞数占5%～25%；阴性(-)，阳性细胞数<5%。按表达情况将研究对象分为两组：低表达组(-～+)和高表达组(～)。

1.4 统计学方法 使用SPSS 19.0统计学软件对相关实验数据进行统计学分析，计数资料以[例(%)]表示，采用χ2检验进行率的比较，CD34-MVD与MMP-2之间的相关性分析采用Spearman等级相关分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-2在胆囊癌与慢性胆囊炎组织中的表达 见表1。MMP-2阳性表达在胆囊癌组织中主要定位于细胞胞浆，呈棕黄色，分布比较均匀，细胞间质内可见部分阳性表达。MMP-2在25例慢性胆囊炎组织中呈阴性表达为19例，6例呈阳性表达，阳性表达率为24.0%。34例胆囊癌组织中MMP-2呈高表达，在胆囊癌中MMP-2的阳性表达率为78.8%(41/52)，其中阴性(-)11例，弱阳性(+) 7例，阳性()11例，强阳性() 23例。MMP-2在慢性胆囊炎和胆囊癌组织中的表达率比较有统计学差异(P=0.0038)。提示MMP-2在胆囊癌组织中表达明显增强。

表1 MMP-2在慢性胆囊炎与胆囊癌组织中的表达[例(%)]

2.2 MMP-2表达与胆囊癌临床病理特征的关系 从性别、年龄、淋巴结转移、组织分化程度、远处转移、临床分期等方面比较MMP-2高表达与低表达在组之间的差异性。统计结果显示，MMP-2高表达与胆囊癌分化程度、有无淋巴结转移、远处转移、临床分期方面有明显的关系(均P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤浸润程度等无关(均P>0.05)。

表2 MMP-2表达与胆囊癌临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 CD34-MVD在胆囊癌与慢性胆囊炎组织中的表达 CD34-MVD在胆囊癌中均值为(53.6±8.9)，慢性胆囊炎均值(19.6±4.15)，两者之间CD34-MVD的表达水平比较有统计学差异(P<0.05)。

表3 CD34-MVD在胆囊癌与慢性胆囊炎组织中的表达

2.4 MMP-2、CD34-MVD在胆囊癌中表达关系的相关性分析 52例胆囊癌中，MMP-2蛋白阳性表达的患者41例、MMP-2蛋白阴性表达的患者11例，CD34-MVD值分别为(50.8±12.3)和(39.9±9.4)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明伴随MMP-2的表达，CD34-MVD值明显增加，肿瘤新生血管明显增多。

表4 胆囊癌中MMP-2与CD34-MVD表达的相关性

3 讨 论

MMPs是降解细胞外基质重要酶类之一，可以降解细胞外基质中的多种蛋白成分和细胞基底膜，从而促进肿瘤细胞在局部和远处组织发生侵袭和转移，与肿瘤的侵袭、转移关系密切[7]。在MMPs家族中MMP-2能降解细胞外基质以及促进肿瘤细胞的浸润和转移，进一步研究发现其可作为肿瘤侵袭、转移的标志物，并且认为MMP-2与恶性肿瘤的浸润转移密切相关[8]。MMP-2 作为一种锌离子依赖蛋白酶，以酶原的形式由肿瘤细胞进行分泌，在被激活后，MMP-2对细胞外基质中Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白、基底膜进行水解，基底膜完整性遭到破坏，对细胞迁移进行调节，进而促进血管生成以及肿瘤的生长，同时参与到肿瘤细胞降解细胞外基质，肿瘤细胞浸润结缔组织基质、侵入小血管及淋巴管而发生转移，从而导致恶性肿瘤侵袭的发生。已有研究[9-10]证明，肿瘤细胞可诱导周围的纤维细胞合成产生更多的MMP-2，从而加速周围组织的恶变。肿瘤周围微血管的形成直接影响肿瘤细胞的生长及发展，CD34作为细胞表面跨膜蛋白，直接参与了细胞间的粘附、造血干细胞运输及炎症反应、白细胞的聚集等，对血管内皮细胞汇聚成管腔过程的研究发现CD34起到重要作用，因此将CD34作为标记微血管密度(MVD)重要的分子生物学指标[12-13]。Min等[14]对乳腺癌中相关蛋白表达进行研究，表明乳腺癌患者总生存率与细胞基质上MMP-2蛋白表达程度呈正向相关，认为MMP-2蛋白通过破坏细胞基底膜，使得肿瘤细胞更加易于侵袭周围组织及淋巴系统。国内学者对甲状腺癌、子宫内膜癌及食管癌等肿瘤中MMP-2的表达进行研究，发现上述恶性肿瘤的发生可能与MMP-2高表达有关，MMP-2可能促进肿瘤新生血管的生成，并且在评估恶性程度和预后方面具有一定意义[15-17]。

本研究发现在胆囊癌组织中MMP-2的表达明显增强，高表达率为65.4%(34/52)，阳性率78.8%(41/52)，其中阴性11例，弱阳性7例，阳性11例，强阳性23例；在15例慢性胆囊炎组织中，阳性表达率24.0%(6/25)，其中阳性6例，阴性14例，MMP-2在胆囊癌及慢性胆囊炎的表达比较具有统计学差异。在淋巴结转移组MMP-2的高表达率明显高于无淋巴结转移组，两者比较差异有统计学意义。在临床Ⅲ,Ⅳ期中MMP-2高表达率明显高于临床Ⅰ，Ⅱ期，两者间比较差异有统计学意义。在不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学分级组间，MMP-2的高表达率比较无统计学差异。这些均提示MMP-2与胆囊癌的发生、发展密切相关。在胆囊癌的患者中，MMP-2高表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及远处转移情况成正相关趋势，提示MMP-2蛋白在肿瘤发生早期开始产生，为肿瘤侵袭转移提供调节。肿瘤的发生发展必然伴随着新生微血管的生成，为肿瘤生长、浸润及转移提供媒介。MMP-2的作用更多的表现为降解细胞外基质的胶原、明胶物质，从而使肿瘤细胞的浸润力更强，以及为促进肿瘤血管的形成做准备。因此MMP-2蛋白的表达程度可以间接反映出肿瘤细胞的恶性程度[18]。

Li等[19]通过免疫组化的方法，对肝细胞癌组织上CD34的表达进行研究，发现其蛋白阳性表达水平显著高于良性肝细胞性病变患者，而另一项研究[20]发现胃肠恶性肿瘤的组织上CD34的阳性表达率高于癌旁组。从我们的研究结果中也可以看出，CD34-MVD表达在胆囊癌中明显高于慢性胆囊炎，可以证实在恶性肿瘤的发生发展中伴随着微血管的生成，且在52例胆囊癌患者中，MMP-2蛋白阳性患者的CD34-MVD结果也较阴性组高，进一步说明肿瘤的侵袭、转移与微血管息息相关。

本研究显示，52例胆囊癌中，41例MMP-2蛋白阳性表达和11例MMP-2蛋白阴性表达的患者，微血管密度均值分别为(50.8±12.3)和(39.9±9.4)，两者比较差异有统计学意义。表明伴随MMP-2的表达，CD34-MVD值明显增加，MMP-2、CD34-MVD在胆囊癌中的表达呈正相关。肿瘤新生血管明显增多，对于胆囊癌的发生、发展以及肿瘤细胞的增殖、迁徙MMP-2与CD34-MVD起着协同作用，因此可以联合检测MMP-2与CD34-MVD，对于胆囊癌的早期诊断、判定胆囊癌的生物学行为有着积极的临床意义。

总之，胆囊癌的侵袭、转移过程中MMP-2蛋白在降解细胞基底膜后，CD34-MVD为肿瘤提供必需的微循环营养及转移所需的血管“桥梁”，两者之间是存在高度相关性的。但是，两者之间是直接调节还是通过某些蛋白或细胞因子进行调节，仍需深入探讨，这为我们下一步研究两者之间的作用机制提供了相关思路。