基于高通量测序的穿心莲连作根际土壤细菌群落多样性分析

周 界，李 明,2，徐友阳，洪 彪，段书蕾，张慧晔，邹江林

(1 广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006； 2 国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，广东 广州 510006； 3 广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州 510515)

中药穿心莲为爵床科Acanthaceae植物穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血、消肿的功效，用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、蛇虫咬伤等[1]，素有“中药抗生素”之称。现代药理研究证明，穿心莲具有抗菌、抗氧化、抗疟、抗血管生成、抗炎、抗糖尿病等多种药理作用，由于其显著的临床疗效而被广泛应用，需求量大幅度增加，但连作障碍问题使其质量和产量不稳定[2]。很多栽培药用植物都存在不同程度的连作障碍, 如人参[3]、西洋参[4]、三七[5]等，药用植物产生连作障碍的原因有很多，主要包括：化感自毒作用、土壤物理性质恶化和养分失衡、土传病害增加、根际土壤微生物群落变化[6-7]等。目前关于穿心莲连作障碍成因的研究主要集中在化感自毒作用[8-12]，也有关于利用平板计数法、BIOLOG微平板法和T-RFLP技术研究连作穿心莲根际土壤微生物的数量、结构和功能多样性的报道[13]。高通量测序技术具有免培养、高通量的优点，是获取大量土壤微生物信息的良好工具[14]，本研究采用16S rRNA 基因高通量测序研究穿心莲连作对土壤细菌多样性及群落结构的影响，为揭示穿心莲连作障碍的成因及作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

土样采集地点位于广东省清远市英德市大湾镇，采集时间为2018年10月。五点取样法采样，利用抖根法收集穿心莲根际土壤，所采土壤样品分为2个处理组：连作组(连作5年穿心莲的根际土壤)和对照组(连作5年穿心莲周边相同母质的未耕作自然土壤)，每组5次重复，所采土样去除植物残体和石砾等杂物后放入灭菌样品袋，置冰盒中运回，在实验室−80 ℃条件下保存，待用。

1.2 仪器与试剂

Daek reader (Clare Chemical Research)；Qubit™fluorometer (Invitrogen)；微型离心机 (Baygene)；涡旋混合器 (其林贝尔)；NanoDrop™ One (Thermo Fisher Scientific)；电泳仪 (北京六一)；凝胶成像仪(Tanon)；PCR 仪 (BioRad)；冷冻离心机 (Eppendorf)。

MOBIO PowerSoil®DNA Isolation Kit(MOBIO)；PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)、DL15000 DNA Marker、100bp DNA Ladder和DL2000 DNA Marker (TaKaRa)；琼脂糖 (浩玛生物)；Primer和 Quant-iT™ Broad-Range DNA Assay Kit (Invitrogen)；E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit(Omega)；NEBNext®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina®(New England Biolabs)。

1.3 细菌多样性测定

DNA提取与PCR扩增：按照DNA 提取试剂盒说明书进行基因组DNA抽提后，利用NanoDrop One 检测 DNA 的浓度和纯度。PCR扩增采用的引物为细菌16S rRNA基因中的V4～V5区引物515 F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR 反应体系为：PremixTaq25 μL，10 mmol/L 的上、下游引物各1 μL，DNA (20 ng/μl) 3 μL，Nuclease-free water 20 μL。PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；然后 94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s进行 30 个循环；72 ℃10 min，4 ℃ 保存。PCR 反应结束后，用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的片段长度和浓度。利用 GeneTools Analysis Software (Version 4.03.05.0, SynGene)对 PCR 产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各 PCR 产物进行混合。使用 E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒回收 PCR 混合产物，TE 缓冲液洗脱回收目标 DNA 片段。

建库与测序：按照 NEBNext®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina®标准流程进行建库操作。使用 Illumina Hiseq 2500 平台对构建的扩增子文库进行 PE250 测序。(以上试验均由广东美格基因科技有限公司完成)。

1.4 数据处理与分析

对Illumina Hiseq 2500测序得到的双端序列数据过滤，进行前期的质量控制，然后根据双端序列之间的重叠关系进行拼接，同时对拼接序列进行质量过滤，得到有效的拼接序列，将具有97%一致性的序列聚类成为可操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)。将每个 OTU 的代表序列与Silva数据库比对，获得代表性序列物种在各分类水平的注释信息。基于 OTU丰度表，使用 QIIME 软件包中的make_rarefaction_plots.py 等脚本进行Observed species指数的稀释曲线数据计算，并使用R 软件绘制稀释曲线。基于均一化的 OTU 丰度表，使用 QIIME 软件包 (V1.9.1)中的 alpha_diversity.py脚本进行4种多样性指数(Observed species、Chao1、Shannon、Simpson)的计算。基于 Unweighted Unifrac距离矩阵，使用 qiime2 和 ggplot2 软件包进行主坐标分析 (Principal coordinates analysis，PCoA)并绘图, 采用 PCoA 及分子方差分析 (Analysis of molecular variance，Amova)进行组间群落结构差异显著性分析。使用R软件绘制柱状图、热图等。使用Excel 2016和SPSS 24.0 软件对试验数据进行统计分析，对处理组间的差异采用独立样本t检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 穿心莲连作处理对土壤细菌α多样性的影响

α多样性分析结果(表1)显示，连作组土壤中的丰富度指数包括Chao1指数和Observed species指数均显著低于对照组(P<0.05)，表明穿心莲连作使土壤细菌群落丰富度显著降低；连作组土壤中的多样性指数包括Shannon指数和Simpson指数均低于对照组，但差异并不显著。整体结果表明穿心莲连作使根际土壤细菌群落多样性减少。

表 1 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌的α多样性1)Table 1 α diversity of bacteria in soil with continuous cropping of Andrographis paniculata and control soil

2.2 穿心莲连作处理对土壤细菌β多样性的影响

β多样性是对不同样品间的微生物群落构成进行比较。PCoA分析中，样品的空间距离越接近，表示样品的物种组成结构越相似。对连作组与对照组土壤样品进行PCoA分析(图1)，PC1的贡献率为33.63%，PC2的贡献率为13.47%，2个主成分的累计贡献率为47.10%，可以表征所有的变量特征。结果显示，对照组的5个样本能够与连作组5个样本明显分开，说明2个处理组样品的物种组成结构产生了明显差异。Amova分析可用于组间群落结构差异显著性分析，P值小于0.05 说明组间差异显著。对连作组与对照组土壤样品进行Amova分析，结果显示Amova分析中P=0.011<0.05，说明两者组间群落结构差异显著。综上所述，穿心莲5年连作显著改变了土壤细菌群落结构。

图 1 穿心莲连作土壤与对照土壤的PCoA (Unweighted Unifrac)分析Fig.1 PCoA (Unweighted Unifrac) analysis of soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

2.3 穿心莲连作处理对土壤细菌群落组成及丰度的影响

基于Unweighted Unifrac距离矩阵，通过非加权组平均聚类分析 (Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)法对连作组与对照组土壤样品进行门水平上的聚类与柱状图组合分析 (图2)。结果显示，连作组5个样本与对照组土壤5个样本在门水平上各自聚为一类，说明穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在门水平上的结构分布。从2个处理共检测到2 769个OTU，分属于47个门，其中变形菌门Proteobacteria (相对丰度为22.53%～27.48%)、酸杆菌门 Acidobacteria (相对丰度为19.62%～28.71%)、拟杆菌门 Bacteroidetes (相对丰度为12.14%～17.75%)、绿弯菌门Chloroflexi(相对丰度为10.96%～11.62%)、浮霉菌门Planctomycetes (相对丰度为5.43%～6.26%)、疣微菌门 Verrucomicrobia (相对丰度为4.24%～4.50%)、放线菌门 Actinobacteria (相对丰度为2.86%～3.18%)、芽单胞菌门Gemmatimonadetes (相对丰度为2.48%～3.53%)、蓝藻细菌门 Cyanobacteria (相对丰度为0.10%～4.81%)、Patescibacteria (相对丰度为0.49%～1.58%)和硝化螺旋菌门Nitrospirae (相对丰度为0.89%～1.09%) 这11个细菌门是2个处理组的主要细菌类群，上述门类相对丰度累计在连作组和对照组土壤中分别占细菌总数的96.44%和95.81%。

图 2 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌在门水平上的UPGMA聚类与柱状图组合分析Fig.2 UPGMA clustering and histogram combination analysis of bacteria in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the phylum level

对连作组与对照组土壤细菌主要细菌门的相对丰度采用独立样本t检验进行差异显著性分析(表2)。结果显示，拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门、绿弯菌门、蓝藻细菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、疣微菌门的相对丰度在2种处理土壤中差异不显著，而变形菌门、酸杆菌门、Patescibacteria的相对丰度在不同处理土壤中差异显著(P<0.05)，其中连作组土壤中变形菌门、酸杆菌门的相对丰度较对照组分别增加了 21.97%、46.33% (P<0.05)，而 Patescibacteria较对照组减少了68.99% (P<0.05)。

表 2 穿心莲连作土壤与对照土壤主要细菌门的相对丰度比较1)Table 2 Comparison of relative abundance of major bacterial phylums in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

在属分类水平上，根据所有样品在属分类水平的物种注释及丰度信息，选取穿心莲连作土壤与对照土壤细菌丰度排名前30个物种及其在每个样品中的丰度信息绘制热图，并从分类信息和样品间差异2个层面进行聚类(图3)。结果显示，穿心莲连作土壤5个样本与对照土壤5个样本丰度排名前30个属的相对丰度各自聚为一类，说明穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在属水平上的结构分布。2个处理组的主要细菌属为黄杆菌属Flavobacterium(相对丰度为1.84%～8.52%)、Bryobacter(相对丰度为1.57%～2.15%)、伯克氏菌属Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(相对丰度为0.24%～2.17%)、HSB_OF53-F07 (相对丰度为1.81%～1.94%)、Candidatus_Solibacter(相对丰度为1.03%～1.76%)、ADurb.Bin063-1 (相对丰度为1.16%～1.65%)、MND1 (相对丰度为0.37%～1.46%)、Acidibacter(相对丰度为0.28%～1.43%)、Mucilaginibacter(相对丰度为0.38～1.37%)、Ellin6067 (相对丰度为0.41%～1.19%)、芽单胞菌属Gemmatimonas(相对丰度为0.57%～1.18%)、Haliangium(相对丰度为0.50%～1.10%)、硝化螺旋菌属Nitrospira(相对丰度为0.88%～1.08%)、Candidatus_Udaeobacter(相对丰度为0.68%～1.07%)和 1921-2 (相对丰度为0.87%～1.00%)。

图 3 穿心莲连作土壤与对照土壤中相对丰度前30的细菌群落在属水平的热图Fig.3 Heat map of bacterial communities with top 30 relative abundances in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control at the genus level

对穿心莲连作土壤与对照土壤细菌主要细菌属的相对丰度采用独立样本t检验进行差异显著性分析 (表 3)。结果显示，HSB_OF53-F07、ADurb.Bin063-1、硝化螺旋菌属、1921-2、Candidatus_Udaeobacter的相对丰度在2种处理土壤中差异不显著 (P>0.05)，而黄杆菌属、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、伯克氏菌属、MND1、芽单胞菌属、Mucilaginibacter、Acidibacter、Ellin6067、Haliangium的相对丰度在不同处理土壤中差异显著(P<0.05)，其中连作组土壤中Bryobacter、Candidatus_Solibacter、Mucilaginibacter、Acidibacter、伯克氏菌属的相对丰度较对照组分别增加了36.94%、70.87%、260.53%、410.71% 和 804.17% (P<0.05)，而黄杆菌属、MND1、芽单胞菌属、Ellin6067、Haliangium的相对丰度较对照组分别减少了78.40%、74.66%、51.69%、65.55% 和 54.55% (P<0.05)。

表 3 穿心莲连作土壤与对照土壤细菌主要细菌属相对丰度比较1)Table 3 Comparison of relative abundance of major bacterial genera in soil of Andrographis paniculata continuous cropping and control

3 讨论与结论

土壤中的微生物群落对植物的生长发育具有重要作用[15]，其中细菌具有维持土壤肥力的作用[16]，连作通常会使土壤细菌数量降低，导致土壤肥力类型由高肥力的“细菌型” 向低肥力的“真菌型”转化[17]。土壤细菌的丰富度和多样性对于维持土壤生态健康发挥着关键作用[18]。本研究发现，5年连作处理使穿心莲根际土壤细菌较对照丰富度显著降低，多样性减少，与谭勇等[19]对未种植三七土壤与3年生三七根际土壤细菌群落多样性水平研究的结果类似。穿心莲在其生长过程中会向土壤中释放阿魏酸、对羟基苯甲酸等酚酸类化感自毒物质[20]。有研究指出，一定浓度的阿魏酸、对羟基苯甲酸及其混合酚酸会抑制土壤氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌的生长[21]。据此可以推测，在本研究中，经过5年连作处理后，穿心莲根际土壤中可能积累了一定量的化感自毒物质而抑制了部分土壤细菌的生长，从而降低了细菌种群多样性和丰富度水平。

本研究结果显示，穿心莲5年连作显著改变了土壤细菌群落结构。从2个处理组土壤样品中共检测到2 769个OTU，分属于47门885属，穿心莲5年连作明显改变了土壤细菌在门和属水平上的结构分布。在门水平上，连作穿心莲根际土壤中优势细菌类群为变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、疣微菌门、放线菌门和芽单胞菌门，与前人研究连作穿心莲的优势细菌类群结果大致相同[13]。在2个处理组中丰度最高的是变形菌门和酸杆菌门，这2种菌门在2个处理组中合计占比均超过40%。变形菌门在土壤中的C、N和S循环中起着关键作用[22]，但同时也含有一些致病菌[23]，因此连作组土壤中变形菌门的相对丰度较对照组显著增加，可能会增加一些不利于穿心莲生长发育的致病菌。酸杆菌门是寡营养细菌[24]，可以作为较贫瘠土壤环境的指示[25]，而连作组土壤中酸杆菌门的相对丰度较对照组显著增加，说明连作土壤的营养状况出现恶化。门水平上变化显著的还有Patescibacteria，但Patescibacteria没有可培养细菌代表，目前对其功能还不了解[26]。在属水平上，有10个优势菌属的相对丰度变化显著(P<0.05)，其中拟杆菌门下的黄杆菌属、变形菌门下的伯克氏菌属、Haliangium尤其值得关注。有报道指出黄杆菌属具有植物促生作用[27]，部分菌群可产生较高活性的几丁质酶抑制植物病原真菌的生长[28]。已有研究从Haliangium中分离出抗植物病原真菌物质，说明Haliangium具有潜在的生防作用[29]。连作组中黄杆菌属和Haliangium相对丰度较对照组显著减少，这2种有益生防细菌的相对丰度显著下降可能导致土壤中植物病原真菌数量增加。伯克氏菌属是一类重要的植物病原细菌，会引起植物腐烂、枯萎和严重坏死等病害症状[30]，因此连作组土壤中伯克氏菌属相对丰度的显著增加可能会对穿心莲的生长发育产生负面影响。

综上所述，穿心莲5年连作降低了土壤细菌丰富度和多样性水平，使土壤微生态系统稳定性降低，同时有益菌相对丰度显著降低，而病原菌相对丰度显著增加造成细菌群落结构改变。土壤细菌丰富度和多样性水平降低，细菌群落结构改变，打破了原有的土壤微生态平衡，可能是穿心莲连作障碍的重要原因之一。合理轮作、间作及施加合适的土壤改良剂等措施可以增加土壤微生物多样性和改善土壤微生物群落结构，对土壤微生态环境产生积极影响，是缓解连作障碍的有效措施[31-34]，目前有关穿心莲连作障碍缓解措施的研究正在进行中。