TET1介导5-羟甲基胞嘧啶表达抑制突变型IDH1过表达胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭

雷梓 陈建功 何颖 李睿 吴莹莹★

胶质瘤是最常见的原发性脑部肿瘤之一，呈浸润性生长，恶性程度高，其中胶质母细胞瘤具有更高的复发率、致残率、死亡率，严重威胁着人类健康［1］。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变是胶质瘤发生发展中重要的分子事件并且可作为分子分型的依据［2］。IDH1 最常见的突变是R132H，占所IDH 突变的80%。有研究显示IDH1 突变是胶质瘤发生过程中的早期事件，在胶质瘤的进展以及复发过程中也起到了重要作用［3］。TET 家族蛋白（ten-eleven translocation protein family，TETs）是一种依赖α-酮戊二酸和Fe2+而发挥催化活性的双加氧酶。TETs 是催化DNA去甲基化过程中的第一步，可将5-甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5mc）转化为5-羟甲基胞嘧（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）非甲基化形式［4］。TET 蛋白介导的DNA 脱甲基化在胶质瘤中起到非常重要的作用［5］。本研究拟探讨TEF1 介导的5-羟甲基胞嘧（5hmC）表达对异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变的U251 胶质瘤细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人胶质瘤细胞U251 购自武汉普诺赛公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；Trziol 试剂盒、逆转录试剂盒购自Invitrogen 公司；IDH1-R132H 突变质粒及TET1 过表达质粒由汉恒生物公司合成；CCK-8 试剂盒、凋亡检测试剂盒购自东仁化学公司；细胞周期检测试剂盒购自七海生物公司；Transwell 小室、Matrigel 基质胶购自美国Corning 公司；IDH1 抗体、TET1 抗体、5hmC 抗体购自Abcam公司。

1.2 细胞培养与转染

U251 细胞使用含10% FBS 的DMEM（H）培养基置于37℃、5% CO2培养箱培养。按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书，细胞融合度达到50%时，IDH1R132H突变质粒及阴性对照质粒转染细胞，转染6 h 后更换新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞检测IDH1、TET1 表达水平。细胞转染IDH1-R132H 质粒48 h 后，继续转染TET1 过表达质粒及过表达对照质粒，转染48 h 用于后续检测5hmC 表达水平及进行功能实验。

1.3 qRT-PCR 检测TET1 mRNA 表达

Trizol 试剂盒提取RNA，分光光度计测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明合成cDNA，qRT-PCR扩增目的基因，检测TET1mRNA 的表达水平，以GAPDH作为内部参照，引物序列见表1。

表1 PCR 扩增引物及条件Table 1 Primers and conditions for PCR amplification

1.4 蛋白免疫印迹法检测IDH1、TET1 蛋白表达

RIPA 裂解液裂解细胞，离心后收集细胞总蛋白，根据BCA 试剂盒说明书进行蛋白浓度测定；SDS-PAGE 电泳后转移至PVDF 膜上，室温封闭1 h，加入一抗（IDH1 抗体，TET1 抗体），4℃冰箱中过夜后室温复温，加入酶标二抗，室温孵育2 h。TBST 洗膜后，ECL 显色，吸干膜上的水分，化学发光信号凝胶成像仪采集图像。

1.5 免疫荧光法检测5hmC 表达水平

制备细胞爬片，使用4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，室温通透20 min；5%正常羊血清室温封闭，加入一抗（5hmC 抗体），4℃冰箱过夜；TBST 漂洗，加入荧光标记二抗，避光、室温孵育2 h；滴加50 μL的抗淬灭封片剂（含DAPI）封片，荧光显微镜下观察结果。

1.6 CCK-8 法检测细胞增殖

转染48 h 后消化细胞，将细胞接种至96 孔板内，每孔接种1 000 个细胞，每组3 孔重复，每孔加入10 μL CCK-8 试剂后培养箱内孵育2 h，使用酶标仪450 nM 波长下检测吸光度。

1.7 细胞划痕实验检测细胞迁移

Ibidi 划痕插件培养皿置于24 孔板中；胰酶消化收集细胞，调整悬液浓度为2.5×104个/mL；在插件左右孔中各加入100 μL 的细胞悬液；当细胞贴壁后将插件拔出，0、12、24 h 倒置显微镜下观察细胞伤口愈合情况并拍照。

1.8 Transwell 侵袭小室实验检测细胞侵袭

使用Matrigel 均匀铺在Transwell 膜上，37℃干胶；小室上室内加入细胞悬液，下室内加入含20%FBS 的无双抗DMEM（H）完全培养基，培养箱内培养48 h。4%多聚甲醛固定液固定10 min，结晶紫染色30 min 后PBS 清洗，显微镜下随机选取5个视野观察并拍照。

1.9 细胞周期检测

收集细胞，70%预冷乙醇4℃固定过夜，PBS 清洗后，离心收集细胞；用500 μL 结合缓冲液重悬细胞，每管加入12.5 μL PI 和10 μL RnaseA 室温避光孵育后流式细胞仪下检测细胞周期。

1.10 细胞凋亡检测

收集细胞，用100 μL 流式凋亡结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC 染色液和5 μL PI 染色液后室温避光孵育15 min 后；PBS 将每管液体量补至1 mL 后流式细胞分选仪下检测细胞凋亡。

1.11 统计学处理

采用SPSS16.0 软件进行数据统计学分析，计量资料用（±s）描述，两组间比较通过t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot 检测结果

Western blot 检测结果显示：与U251-NC 细胞相比，U251-IDHR132H细胞中IDH1 蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1A、B），TET1 蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1A、C），免疫荧光检测显示U251-IDHR132H细胞中5hmC 的蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1D）。

图1 Western blot 检测结果Figure 1 Western blot results

2.2 人胶质瘤U251 细胞过表达IDH1R132H 与TET1，TET1 及5hmC 表达水平上调

Western blot 检测结果显示：与U251-NC 细胞相比，U251-IDHR132H-TET1细胞中TETmRNA及蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2A、B、C），免疫荧光检测显示U251-IDHR132H-TET1 细胞中5hmC 的蛋白表达显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2D）。

图2 U251 细胞过表达IDH1R132H及TET1 后TET1 及5hmC 表达水平Figure 2 Expression levels of TET1 and 5HMC after over expression of IDH1R132h and TET1 in U251 cells

2.3 过表达IDH1R132H 与TET1 促进U251 细胞增殖、迁移、侵袭能力。

与U251-NC 细胞相比，U251-IDHR132H-TET1（U251-TET1）细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A），迁移能力降低，侵袭能力降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3B、C）。

2.4 过表达IDH1R132H与TET1 对U251 细胞周期及凋亡的影响

与U251-NC 细胞相比，U251-IDHR132H-TET1 细胞G1 期明显增加，S 期和G2 期明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞凋亡实验结果显示与U251-NC 细胞相比，U251-IDHR132H-TET1 细胞凋亡明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

IDH 1 和IDH 2 在人类恶性肿瘤的发生和发展中所起的重要的作用［6-7］。现有研究表明，IDH酶通常催化异柠檬酸的脱羧作用生成a-酮戊二酸（a-KG），在此过程中产生还原型辅酶II（NADPH），IDH 1 是人大脑及其他组织中NADPH的主要来源。NADPH 通过减少氧化谷胱甘肽来保护机体免受氧化损伤。IDH 1 通过异柠檬酸氧化脱羧生成NAPDH 以防止脂质过氧化和DNA 氧化损伤［8］。因此，野生型IDH1 和IDH2 在管理氧化应激对各种细胞损伤反应的程度方面起着重要作用。IDH1 突变赋予了一种新的酶活性，催化α-KG 还原成假定的共代谢物D-2-羟基谷氨酸（D2HG）。D2HG 能抑制几种a-KG 依赖性双加氧酶活性，包括组蛋白去甲基化酶及10-11 易位-双加氧酶（TET）家族［9］。TET 蛋白在腺苷三磷酸及二价铁和α-KG 存在的情况下通过它的结构域能够催化5-mC 转变成5-hmC［10］。5mC 和5hmC 表观遗传标记的功能的重要性及其调控作用已在许多生物学过程中得到确认［11］。5hmC 被发现存在于不同种类的细胞内，特别在干细胞和中枢神经细胞内的含量非常高，5-hmC 作为DNA 去甲基化多重步骤中重要的中间产物，其水平在肿瘤的发生和发展过程中发生显著变化［12］。多项研究提示IDH 突变导致肿瘤发生的一个主要机制是抑制TET 酶以及由此引起的以5hmC 为代表的DNA 去甲基化动力学失调。据此，本研究探讨TEF1 介导的5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）表达对异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变的U251 胶质瘤细胞生物学行为的影响。

课题组先将IDH1-R132H 突变质粒转入胶质瘤U251 细胞中，观察IDH1 突变对细胞中TET1 以及5hmC 表达水平的影响，结果显示IDH 突变可显著抑制TET1 及5hmC 的表达。随后将TET1 过表达质粒转入IDH1-R132H 突变U251 细胞中，结果显示TET1 过表达引起了5hmC 水平的升高，显著抑制了胶质瘤细胞的生长、增殖，促进胶质瘤细胞的凋亡。相关研究发现，5hmc 表达下降是促进肿瘤进展的表观遗传学特征［13］，Xu 等也在液相质谱分析中发现，IDH 突变导致5hmc 下降，IDH1R132H的表达通过抑制TET 1 和TET2 酶的活性而降低5hmC 在HEK293 细胞中的丰度［14］。这些发现与本组得出的结果一致，表明IDH 突变导致肿瘤发生的一个主要机制是抑制TET 酶以及由此引起的以5hmC 为代表的DNA 去甲基化动力学失调，可能为胶质瘤的靶向治疗提供新思路。

图3 过表达IDH1R132H与TET1 促进U251 细胞增殖、迁移、侵袭能力Figure 3 Overexpression of IDH1R132H and TET1 promoted the proliferation,migration and invasion of U251 cells

图4 过表达IDH1R132H与TET1 对U251 细胞周期及凋亡的影响Figure 4 Effects of overexpression of IDH1R132H and TET1 on cell cycle and apoptosis of U251 cells