益气活血方对大鼠心肌梗死后心肌肥大的影响及作用机制

魏路路 郭书文 冯鹏飞 王惠 黄琦惠 刘云柯 魏梵域

心肌梗死是由于持续性缺血和缺氧而引起的心肌坏死疾病[1]，是导致全球范围内心血管疾病高死亡率的主要因素[2]。心肌肥大作为心肌梗死后的适应性反应[3]，是诱发心力衰竭的主要风险因素[4]，因此防治心肌肥大是治疗心肌梗死的重要方向。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的重要组成部分，可促进心脏生长[5]，参与心肌肥大的发生与发展[6]。课题组常用研究组方益气活血方在前期研究中显示能够抑制大鼠心肌梗死后的心室重构，本研究重点观察益气活血方对心肌梗死大鼠心肌肥大相关指标的影响，并探究其是否与细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠50只，体重200～220 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0006，饲养于北京中医药大学SPF级动物房，饮食由动物房提供。

1.2 药物的制备

益气活血方由生黄芪30 g、当归15 g、人参10 g、三七6 g、川芎15 g组成，购买于北京中医药大学国医堂门诊部(该药已申请专利，申请号为201610368030.7)。由中日医院药剂科制备，按照口服剂制作工艺，按处方称取中药材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5小时，共5小时，水煎液过滤、浓缩，调整浓度为1∶2(每毫升溶液对应生药0.82 g)，分装于100 mL玻璃瓶，灭菌备用。

对照药酒石酸美托洛尔片，阿斯利康制药有限公司，国药准字H32025391，生产批号：1805A23，规格：25 mg×20片。

1.3 模型的建立

采用结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending，LAD)的方法制作急性心肌梗死动物模型。动物麻醉选用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射，麻倒后仰卧位固定于鼠板，剃毛备皮，行气管插管，连接小动物呼吸机。定位左侧第三、四肋间横向剪开皮肤及肌肉，撕开心包膜，充分暴露心脏，以冠脉主干为标志，在左心耳下2 mm处用5/0无菌带线缝合针结扎LAD。以结扎部位及以下区域变白为结扎成功的标志。将心脏复原，关胸缝合，脱离呼吸机，尽快恢复自主呼吸。假手术组仅将手术线穿过LAD，不结扎，其余步骤同模型组相同，手术过程严格无菌操作。以术后30分钟心电图ST段抬高并且24小时心电图出现5个以上病理性Q波为造模成功的标志。

1.4 分组及给药

用随机数字表法将造模成功的大鼠随机分配，分为模型组、益气活血药组、酒石酸美托洛尔组，另设假手术组，每组9只。干预治疗7天后进行相关检查。术后第2天给予相应药物灌胃，益气活血药组[8.2 mg/(kg·d)]，酒石酸美托洛尔组[5 mg/(kg·d)]，模型组和假手术组给予等量蒸馏水，每日1次。

1.5 检测指标

1.5.1 超声检测左心功能指标 采用影像Vevo770高分辨小动物超声系统(加拿大Visual Sonics公司)检测左心功能指标，通过高频探头RMV716取左室短轴切面，获得M型曲线并进行分析，连续取3个心动周期，计算平均值。主要参数为：左室射血分数(left venteicular ejection fraction，LVEF)、左室短轴率(left ventricular shortening fraction，LVFS)、左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)和左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)。

1.5.2 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 将心肌组织用4%多聚甲醛固定，24小时后取出固定材料进行常规包埋切片(4 μm)，行HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树脂封片，切片于全景扫描仪中观察并采集图像。用Image-Pro Plus软件完成横截面积、直径和周长的测量。

1.5.3 免疫组化法检测梗死边缘区心房钠尿肽的表达 石蜡切片脱蜡至水，将组织切片置于盛满乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修复缓冲液(pH 8.0)的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，冷却后放于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤，之后放入3%过氧化氢溶液，阻断内源性过氧化物酶，画圈，血清封闭，加入配置好的一抗，4°C孵育过夜，加入二抗，孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，去除PBS溶液，加新鲜配制的二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，于全景扫描仪中观察并采集图像。

1.5.4 免疫印迹法(western blot，WB)检测梗死边缘区蛋白表达情况 通过WB检测各组大鼠梗死边缘区心肌肥大相关指标心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、β肌球蛋白重链(β-mysion heavy chain，β-MHC)的蛋白表达情况。为进一步探究益气活血方治疗心肌肥大与ERK通路的关系，故仅予观察益气活血组、模型组与假手术组ERK1/2、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2)的蛋白表达情况。按照试剂盒的说明进行样本蛋白的提取以及调配相应浓度凝胶，取50 μg样本蛋白在SDS-PAGE凝胶上电泳，浓缩胶恒压80 V约20分钟，分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部，湿转转膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(转模时间2小时)，转移结束后将PVDF膜浸泡于WB封闭液中摇床轻摇1小时，加入经1%BSA/5%milk稀释好的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入对应的二抗室温轻摇50分钟，再次TBST洗膜，最后将PVDF膜浸泡于ECL显色液中1分钟，暗室中曝光，显影并定影，条带灰度值采用Quantity One v.4.6.2软件进行读取，各组分别与内参β-action比较得到相对光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 益气活血方对各组大鼠小动物超声结果

模型组大鼠相较假手术组LVFS、LVEF均显著降低(P<0.01)，LVIDs、LVIDd均显著升高(P<0.01)。两用药组相较模型组LVFS、LVEF均显著升高(P<0.01，P<0.05)，LVIDs、LVIDd均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2 益气活血方对各组大鼠HE染色及横截面积、直径、周长的结果

HE染色结果显示：假手术组心肌细胞排列整齐， 胞核位于细胞中央， 未见炎性细胞浸润。模型组细胞形状不规则，排列紊乱，胞核游离，细胞间隙变大，伴随炎性细胞浸润。两用药组相较模型组，排列相对整齐，细胞间隙变小，胞核游离情况减轻，见图1。

表1 益气活血方对各组大鼠小动物超声结果

梗死边缘区心肌细胞的横截面积、直径和周长结果如表2所示。与假手术组相比，模型组心肌细胞横截面积、直径和周长均显著增高(P<0.01)；与模型组相比，两用药组三者均显著降低(P<0.01，P<0.05)。

图1 各组大鼠心肌细胞HE染色比较(×400)

表2 益气活血方对各组大鼠心肌细胞横截面积、 直径和周长的结果比较

2.3 益气活血方对各组大鼠免疫组化检测梗死边缘区ANP的表达结果

假手术组心肌细胞排列整齐且清晰，模型组ANP阳性表达主要在细胞质和细胞核中，可见大片棕褐色颗粒聚集成片，少量细胞核淡蓝色表达。两用药组相较模型组呈少量ANP表达阳性，表达部位呈浅染或深染的棕色颗粒，见图2。

图2 各组大鼠ANP蛋白的表达结果(标尺=50 μm)

2.4 益气活血方对各组大鼠梗死边缘区心肌肥大指标ANP、β-MHC蛋白的表达

检查各组大鼠梗死边缘区心肌肥大指标ANP、β-MHC蛋白的表达情况显示：与假手术组相比，模型组的ANP、β-MHC蛋白均显著提高(P<0.01)；与模型组相比，两用药组的ANP、β-MHC蛋白均显著下降(P<0.01)，见表3、图3。

表3 益气活血方对各组大鼠ANP、β-MHC蛋白 表达比较

注：J为假手术组；M为模型组；Y为益气活血组；MT为美托洛尔组

2.5 益气活血方对各组大鼠梗死边缘区心肌细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达

检查心肌细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达情况显示：与假手术组相比，模型组的p-ERK1/2蛋白显著升高(P<0.01)，ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，益气活血组的p-ERK1/2蛋白显著降低(P<0.01)，ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图4。

表4 益气活血方对各组大鼠梗死边缘区ERK1/2、 p-ERK1/2蛋白的表达比较

注：J为假手术组；M为模型组；Y为益气活血组

3 讨论

心肌梗死发生后，为了补偿功能性心肌细胞的损失，心脏会发生一系列的结构改变来完成重构[7]。心室重构的潜在机制是多因素的，如氧化应激、炎症、肥大和纤维化[8]。肥大和纤维化是进行性心脏病的早期指征，增加了心力衰竭、复发性心梗、心律不齐和猝死的风险[9]。益气活血方是治疗胸痹的经验方，临床上取得了良好的疗效。课题组的前期研究发现[10-11]，益气活血方能够很好的延缓纤维化，增强抗氧化能力，抑制细胞凋亡和坏死，从而防治心肌梗死后的心室重构。本研究重点观察益气活血方对心肌梗死后心肌肥大的影响，并探究其可能的作用机制，为了更直观的对比该方的疗效，选用酒石酸美托洛尔作为对照药。

本研究通过结扎左冠状动脉前降支的方法制作了心肌梗死大鼠模型，并进行了超声和HE染色以及心肌肥大特应性指标如心肌细胞横截面积、直径、周长的测量，模型组与假手术组相比，LVIDs、LVIDd、横截面积、直径、周长都显著增高，EF、FS显著降低，反映出心梗模型的建立是成功的，并且发生了心肌肥大的适应性改变。益气活血药组与模型组的对比证明益气活血方能够改善心肌梗死后的心肌肥大状况，减轻心室重构。

ANP是心脏分泌的一种肽激素，属于利钠肽家族的一员[12]。ANP的主要功能为利钠、利水和舒张血管，能够维持水盐平衡。当心肌细胞承受更高的血流压力时，它会上调血管紧张素的表达，从而释放出更多的ANP，导致心肌肥大的发生[13]，因而ANP常被看做心肌肥大的标志基因。β-MHC是肌球蛋白的基本成分，可为肌肉收缩提供动力。心肌肥大时常常伴随着β-MHC的上调[14]。β-MHC表达的上升与ANP的过表达常被看做心肌肥大的标志。本研究中模型组的ANP和β-MHC的表达相较假手术组均显著升高，这与CHEN等[15]的研究是一致的。益气活血药组与模型组相比，益气活血方能够降低心肌肥大的程度，抑制ANP和β-MHC蛋白的表达。

心肌肥大是心脏在受到有害刺激时为了维持心输出量而进行的适应性和代偿性改变[16]。主要分生理性肥大和病理性肥大两种，前者是心脏在面对外来刺激时做出的顺应性改变，对机体是无害的，后者是面临病理刺激时发生的不可逆的适应不良性肥大。ERK信号通路是最重要的信号转导途径之一，它能够调节细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物反应[17]，ERK通路的激活参与生理性和病理性肥大[18]。本研究通过对ERK1/2与p-ERK1/2蛋白表达的检测，发现模型组中磷酸化ERK1/2蛋白较假手术组显著增高，说明ERK1/2信号通路在模型组被激活，而益气活血药组可显著降低磷酸化的ERK1/2蛋白，因此我们推测益气活血方改善心肌梗死后的心室肥大可能与抑制ERK1/2信号通路有关。