芪参益气滴丸联合骨髓间充质干细胞移植改善小鼠心肌梗死有效性研究

何贵新 肖婷 秦伟彬 谭炜 林琳 任加以 陈天宇 吴凯 玉黎燕

急性心肌梗死是发病率、致死率很高的疾病之一，急诊冠脉介入术的推广使得急性心肌梗死的死亡率大幅下降。但存活患者的心功能无法恢复正常。干细胞治疗的出现为急性心肌梗死的治疗带来新的希望。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)，具有在体外分化为心肌细胞的潜力，因此移植干细胞的最初设想是它们能够在体内分化成为有收缩功能的心肌细胞，以代替损失的心肌细胞，进而恢复心脏收缩功能、逆转心室重构[1]。尽管干细胞具有向心肌细胞和内皮细胞分化的潜力，但由于移植入梗死区存活的干细胞数量极少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了干细胞对于心肌梗死的治疗效果[2]。

近些年来，中药的心肌保护作用受到越来越多的关注。芪参益气滴丸的四种主要成分为黄芪、丹参、三七、降香，其主要活性成分包括黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、人参皂苷Rg1、丹参酮ⅡA等，这些成分具有抑制细胞凋亡，维持正常能量代谢、抗炎、清除氧自由基等多种药理作用[3-5]。心肌梗死后的局部微环境是非常恶劣的，能影响骨髓间充质干细胞移植后的归巢和存活，同时梗死心肌局部的炎症反应也阻碍了移植的骨髓间充质干细胞存活和分化。既往的研究发现单一的干预措施难以成功，而多途径、多靶点的方法能优化干细胞的移植效率。鉴于芪参益气滴丸具有上述多靶点多效应的作用，课题组提出假说：芪参益气滴丸可以显著改善心肌梗死后局部组织微环境，提高移植入梗死区干细胞的存活，从而起到优化干细胞移植效力，改善心功能的作用。此研究通过运用小鼠心肌梗死模型，评估芪参益气滴丸对干细胞移植治疗心肌梗死的优化价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究所涉及的动物实验严格遵循美国国家卫生机构发布的《实验动物保护和应用指南》(NIH Publication NO.85-23，1996年修订)相关规定。本实验所采用的动物均为C57BL/6雄性，SPF级，8周龄小鼠，均购自南京大学模式动物研究所，在南京大学医学院附属鼓楼医院SPF级动物房内饲养两周后行本部分实验。

1.2 主要实验药物

芪参益气滴丸：黄芪、丹参、三七、降香油，天士力医药集团股份有限公司，批号：180615，每袋装0.5 g。

1.3 主要仪器与试剂

小动物呼吸机(上海玉研科学仪器有限公司)、小动物体表心电图(上海玉研科学仪器有限公司)、气体麻醉系统(上海玉研科学仪器有限公司)、可拍照光学显微镜(Olympus公司)、倒置荧光显微镜(Olympus公司)、普通光学显微镜(上海点应光学仪器有限公司)，一抗Rabbit anti-CD3、anti-Ki67(Abcam公司)。二抗：Alexa Flour®594 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG (H+L，Invitrogen)、辣根过氧化物酶标记Goat anti-Rabbit IgG (H+L，北京中杉金桥)、DAPI(Invitrogen)、TUNEL试剂盒(Roche)、Trinton X-100(Sigma)。

1.4 分组及给药

随机将小鼠分为PBS组、干细胞组和干细胞联合芪参益气滴丸组，每组20只实验小鼠。造模前10天开始灌胃，直至处死。干细胞联合芪参益气滴丸组予芪参益气滴丸溶液(3.9 mg/mL，饮用水溶解)灌胃，PBS组和干细胞组予等量饮用水灌胃，每次灌胃0.1 mL/天。

1.5 小鼠心肌梗死模型及干细胞移植

造模前分离培养骨髓间充质干细胞，计数后PBS重悬，细胞密度为2.5×107个/mL，置冰上，转移至动物手术室内。实验过程中采用开胸结扎前降支的方法建立小鼠心肌梗死模型。10%水合氯醛腹腔注射，充分麻醉后将小鼠仰卧位固定于小鼠固定板上，脱毛膏脱去胸前及颈部毛发，消毒后纵向切开颈部皮肤，钝性分离至气管，可视下行气管插管术，接小动物呼吸机辅助呼吸，参数为频率110 bpm，吸呼比1∶1.2，潮气量1.8 mL。沿肋骨走形方向，切开胸骨左缘第三、四肋间隙的皮肤，钝性分离胸大肌，暴露肋间隙，眼科剪小心剪开肋间肌肉，开胸器撑开肋骨暴露心脏。眼科镊子轻轻撕开心包膜，充分暴露左心耳。在左心耳下缘2 mm左右，用7-0带针丝线垂直于冠脉走行方向，从冠脉下方的心肌内穿过并结扎。体表心电图提示ST段抬高，并可见左心室前壁心肌变白，室壁运动减弱，提示结扎位置正确，建立心肌梗死模型成功。

使用30 G的进样针(Hamilton)抽取20 μL干细胞悬液(约5×105个)，在梗死区和梗死周围区取四个点均匀注射，每个点注射5 μL。PBS组抽取20 μL PBS，注射方法相同。注射完毕用无菌棉球按压数秒。然后用4-0丝线逐层缝合肋间隙、胸大肌以及皮肤。待小鼠恢复自主呼吸后，撤出呼吸机保留气管导管，意识清醒后拔除气管导管。

1.6 观察指标

1.6.1 血管新生观察 观察三周后处死实验小鼠，留取心脏标本。4%多聚甲醛固定24小时之后，弃去固定液，沿心尖段、中段和心底段三个横截面将心脏切成三段，室温下脱水，透明，浸蜡，包埋，包埋蜡块时从心底部至尖切成2段包埋，每组8个蜡块，每个蜡块至少制作3张切片(6个切面)。脱蜡、水化后，进行抗原修复：将浸泡在10 mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中玻片加热，使之维持在95～99℃，10分钟，取出、自然冷却30分钟，PBS润洗5分钟×2次，3%H202中孵育10分钟，加入稀释的二抗，37℃孵育60分钟。加入DAB显色，在显微镜下观察染色进展，一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中终止显色。为了观察骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植是否能影响梗死区和边缘区的血管新生，行免疫组织化学染色，anti-CD31用于标记血管内皮细胞。

1.6.2 细胞凋亡检测 切片脱蜡、水化同上，使用蛋白酶K(10～20 μg/mL)在21-37孵育15～30分钟，PBS润洗5分钟×3次。准备TUNEL混合液：50微升酶溶液+450微升稀释液，将TUNEL混合液加至组织切片上，完全覆盖，37℃避光孵育60分钟，加入DAB显色，在荧光显微镜观察GFP荧光蛋白，将切片泡在苏木精溶液中复染，切片用蒸馏水洗5分钟×3次，风干后，中性树胶封片。为了观察骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植是否能影响梗死区(infarcted area)和边缘区(border zone)的细胞凋亡，病理切片行免疫组织化学染色，TUNEL assay被用于标记凋亡细胞。通过荧光显微镜计数第21天时TUNEL+与GFP+重叠的细胞数，评价移植后MSCs在心肌中的凋亡情况，定量评价芪参益气滴丸对移植后MSCs凋亡的影响。

1.6.3 细胞增殖检测 为了观察骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植对梗死区和边缘区细胞增殖的影响，病理切片行免疫组织化学染色，anti-Ki67被用于标记增殖细胞。每个切面随机选取6个不同的视野拍照分析，同时，每个蜡块样本随机选取一张切片，选取6个不同的视野，采用LEICA Qwin V3 图像分析系统，分析单位心肌面积内血管密度, 进行小鼠心肌梗死区、边缘区微血管密度定量分析，计算小鼠心肌单位面积内微血管的密度。并且对梗死区和边缘区Ki67阳性的细胞进行定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植对心肌梗死小鼠血管新生的影响

对梗死区微血管密度定量分析，结果显示：PBS组与干细胞组组间比较差异有统计意义(P<0.01)；与PBS组相比，干细胞联合芪参益气滴丸组微血管密度明显增加(P<0.001)；但与干细胞组相比，差别无统计学意义(P>0.05)，说明与注射PBS相比，移植MSCs能明显促进梗死区的血管新生。

对边缘区的微血管密度进行定量分析，结果显示：PBS组与干细胞组组间比较差异有统计意义(P<0.05)；与PBS组和干细胞组相比，干细胞联合芪参益气滴丸组的微血管密度显著增多(P<0.01和0.05)，说明与注射PBS相比，移植MSCs能促进边缘区的血管新生，芪参益气滴丸联合移植MSCs能进一步增加边缘区的微血管数量。见表1。

表1 骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植 对心肌梗死小鼠微血管密度定量分析

2.2 骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植对梗死小鼠细胞增殖的影响

对梗死区Ki67阳性的细胞进行定量分析，结果显示： PBS组与干细胞组组间比较差异有统计意义(P< 0.01)；与PBS组和干细胞组相比，干细胞联合芪参益气滴丸组的细胞增殖明显活跃(P< 0.001和0.05)。

对边缘区Ki67阳性的细胞进行定量分析，结果显示： PBS组与干细胞组组件比较差异有统计意义(P< 0.01)；与PBS组相比，干细胞联合芪参益气滴丸组Ki67阳性的细胞显著增多(P<0.001)，说明与注射PBS相比，移植MSCs能明显促进细胞增殖，芪参益气滴丸联合移植MSCs能进一步促进梗死区和边缘区的细胞增殖。见表2。

2.3 芪参益气滴丸对移植后骨髓间充质干细胞凋亡的影响

干细胞组共计数4406个GFP+细胞，其中TUNEL+细胞共2300个，占52.20%；干细胞联合芪参益气滴丸组共计数6059个GFP+细胞，其中TUNEL+细胞共2174个，占35.88%。组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明芪参益气滴丸能抑制MSCs移植后凋亡的发生。见表3。

表2 骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植 对梗死小鼠细胞增殖的影响

表3 芪参益气滴丸对移植后 骨髓间充质干细胞凋亡的影响(n=10)

2.4 芪参益气滴丸对移植后骨髓间充质干细胞存活率的影响

PBS组未见有GFP+细胞，干细胞组共计数了45827个DAPI+细胞，其中GFP+细胞为4872个，占10.63%；干细胞联合芪参益气滴丸组共计数了49546个DAPI+细胞，其中GFP+细胞为7284个，占14.70%，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明芪参益气滴丸能提高MSCs移植后的存活率。见表4、图1。

表4 各组小鼠心肌内骨髓间 充质干细胞(MSCs)的存活情况 (n=10)

注：蓝色荧光为DAPI，代表细胞核；绿色荧光为GFP，代表移植的MSCs。

3 讨论

既往研究表明，干细胞在体外具有自我更新、无限增殖以及分化为多种细胞的潜能[6]，大部分研究都把干细胞可以作为心肌再生的可靠来源。骨髓间充质干细胞(MSCs)是目前研究的最多的干细胞，临床和动物研究都表明干细胞移植确实能改善心功能、抑制心室重构[7-8]。尽管MSCs具有向心肌细胞和内皮细胞分化的潜力，但由于移植入梗死区存活的MSCs数量极少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了MSCs对于心肌梗死的治疗效果[9]。如何提高移植MSCs的疗效是亟待解决的问题。在本研究中，课题组观察了骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸移植治疗急性心肌梗死小鼠的有效性。与移植MSCs相比，芪参益气滴丸联合移植MSCs能进一步增加边缘区的微血管数量，抑制梗死区的细胞凋亡，以及促进梗死区和边缘区的细胞增殖。实验结果充分说明在治疗小鼠急性心肌梗死方面，芪参益气滴丸联合移植MSCs的疗效优于单纯移植MSCs。

心肌局部的微环境能影响MSCs的归巢和存活，炎症反应、活性氧簇都能诱发MSCs凋亡，也能影响MSCs向心肌细胞转化的效率。研究者试图在体外对干细胞进行一系列修饰，以增强其生存能力[10]，或者通过注射调控蛋白改善局部微环境，从而提高干细胞的存活率[11]，或者抑制局部的炎症反应，使得干细胞免受炎症因子攻击[12]。尽管实验发现上述措施都是有效的，其临床应用却存在诸多困难。不过这些研究表明，改善心肌局部的微环境是提高MSCs存活的有效途径。

目前，中药的心肌保护作用受到较多的关注。芪参益气滴丸是一种临床上常用于治疗急性心肌梗死和慢性心衰的复方中成药，其四种主要成分为黄芪、丹参、三七、降香，药理学实验提示其有效成分具有抑制细胞凋亡、维持正常能量代谢、抗炎、清除氧自由基等多种药理作用。芪参益气滴丸也能通过调节心肌细胞能量代谢[13]，抑制细胞色素C释放[14]，保护线粒体结构和功能，减少白细胞浸润，从而减轻缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。有效成分丹参酮 ⅡA可增加B淋巴细胞瘤-2蛋白表达，下调急性心肌缺血时BCL-2同源的水溶性相关蛋白的表达，从而减少心肌细胞凋亡[15]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是参与心肌缺血损伤过程的重要的细胞成分之一，三七总皂苷通过抑制NF-κB 的活化，减少内皮细胞损伤而起到心肌保护的作用[16]。三七总皂苷还能通过升高中性粒细胞内的环磷酸腺苷，减轻脂质过氧化损伤，抑制氧自由基生成，而抑制其释放炎症因子，减轻心肌细胞损伤[17]。由于芪参益气滴丸具有上述多靶点多效应的作用，因此课题组提出假设，芪参益气滴丸可以显著改善心肌梗死后局部组织微环境，提高移植入梗死区干细胞的存活，从而起到优化干细胞移植效力，改善心梗后心室重构的作用。本实验也证实了此假说，骨髓间充质干细胞联合芪参益气滴丸治疗心梗后心室重构的疗效优于单独行MSCs移植。