固本抑瘤Ⅱ号对乳腺癌小鼠RECQL4蛋白和mRNA表达的影响

徐晓华 刘敏 李可欣 张青

据GLOBOCAN 癌症数据统计，2018年全球乳腺癌新发病例为2088849，死亡病例为626679，其发病率(11.6%)和死亡率(6.6%)位居女性首位[1]。尽管目前有放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗等多种治疗手段，但仍无法完全根治此病，寻找更有效的治疗方法是目前乳腺癌治疗亟待解决的问题。

RECQL4属于RECQ解旋酶家族(WRN，BLM，RECQL4，RECQL1和RECQL5)之一，存在于端粒和线粒体，具有解旋酶活性[2]，是正常细胞和癌细胞DNA复制起始因子之一，可以参与维持基因组稳定性的蛋白质相互作用[3]。RECQL4 基因C端区域突变可导致具有癌症易患性的Rothmund-Thomson综合征[4]，此外，RECQL4蛋白和/或mRNA也可在乳腺癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]、前列腺癌[8]、骨肉瘤[9]等多种肿瘤中过表达，且多与预后不良相关。故本研究以固本抑瘤Ⅱ号为主，通过体内实验观察其疗效，并探索其与RECQL4表达的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验动物

4T1-荧光素酶标记(4T1-luc)小鼠乳腺癌细胞来自首都医科大学附属北京中医医院中心实验室。SPF级雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重20±2 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。小鼠饲养于首都医科大学实验动物科学部，独立通风笼(IVC)环境中。本研究已通过首都医科大学动物伦理委员会批准(AEEI-2018-089)。

1.2 试剂及仪器

固本抑瘤Ⅱ号由生黄芪(13.45%)、党参(6.73%)、女贞子(6.73%)、茯苓(4.48%)、生白术(4.48%)、枸杞子(6.73%)、仙灵脾(4.48%)、川芎(4.48%)、鸡血藤(13.45%)、莪术(4.48%)、肿节风(6.73%)、浙贝母(6.73%)、苦参(5.38%)、水蛭(2.69%)、昆布(8.97%)共15味药物组成，均购自首都医科大学附属北京中医医院。煎煮方法：将草药放入锅内，加入10倍体积去离子水，浸泡30分钟后开始加热，煮至沸腾，继续煎煮30分钟，将第一煎药液用80目筛过滤后盛出。锅中继续加入5倍体积去离子水进行第二煎，煮沸后煎煮25分钟，过滤后与第一煎药液混合，浓缩成药物浓度为2.87 g/mL的药液备用。盐酸阿霉素(北京索莱宝科技有限公司；货号:D8740)；RNAsimple总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司；货号DP419)；FastQuant RT Kit(With gDNase)(天根生化科技有限公司；货号KR116-02)；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Biotool；货号B21203)；Pierce ECL Western Blotting Substrate(Pierce；货号32106)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce；货号：23227)；RECQL4抗体(Sdix；货号2547.00.02)；β-Actin抗体(北京普利莱基因技术有限公司；货号C1313)；山羊抗小鼠/抗兔IgG抗体HRP标记(北京普利莱基因技术有限公司；货号C1308、C1309)。

荧光定量PCR仪CFX96(美国Bio-Rad)；Mini电泳仪、Mini转膜仪(美国Bio-Rad)；Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)；Alpha化学发光凝胶成像系统FluorChem FC3(美国ProteinSimple)，5804R高速大容量冷冻离心机(德国Eppendorf)。

1.3 4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型制备

取对数生长期的4T1-luc细胞，配成1×106/mL的细胞悬液，将小鼠用异氟烷气体麻醉后进行接瘤，每只小鼠乳垫下注射50 uL(5×104个细胞)细胞悬液[10]。

1.4 分组及给药

按体重将荷瘤小鼠随机分为对照组、中药组、阿霉素组和中药+阿霉素组，每组6只，接种后24小时开始给药，共28天。参考徐叔云的《药理实验方法学》，人和小鼠的体表面积折算的等效剂量比值为0.0026，故小鼠每日中药用量为0.580 g，即0.202 mL，为操作方便，灌胃时取0.2 mL/天。阿霉素用蒸馏水配成0.5 mg/mL，4℃避光保存。具体给药方法：对照组、中药组分别予0.2 mL蒸馏水和中药灌胃，1次/日，阿霉素组予阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日，中药+阿霉素组予0.2 mL中药灌胃联合阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日。

1.5 小鼠体重、原位瘤长短径及瘤重测量

给药后每隔7天称量小鼠体重，同时用游标卡尺测量小鼠长径(a)和短径(b)，在给药第28天手术切取小鼠乳腺原位瘤称重，计算并比较各组小鼠的原位瘤体积和抑瘤率。

肿瘤体积=a×b2/2

抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤)×100%

1.6 RealtimePCR检测原位瘤组织RECQL4 mRNA表达

利用天根RNA提取试剂盒提取总细胞RNA，1 μg RNA合成cDNA。引物序列见表1，以上引物由Invitrogen公司合成。常规方法，实时定量PCR，获得CT值。用2-△△CT方法分析各组小鼠目的基因的表达并比较。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 Western-Blot检测原位瘤组织RECQL4蛋白表达

研磨乳腺原位瘤组织，提取蛋白后BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，用5% BSA室温封闭2小时。分别加入稀释后的一抗β-Actin(抗体按1:1000稀释)和RECQL4(抗体按1∶10000稀释)，孵育4℃冰箱过夜，TBST洗膜5 min×3次，分别加入HRP标记的山羊抗小鼠/抗兔IgG抗体(抗体按1∶5000稀释)室温孵育1小时，用显影仪曝光。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 固本抑瘤Ⅱ号对小鼠原位瘤瘤重和抑瘤率的影响

与对照组相比，中药组、阿霉素组和中药+阿霉素组瘤重均明显减轻(P<0.01)，抑瘤率分别为25.23%、41.44%、59.46%，且中药+阿霉素组瘤重低于中药组和阿霉素组(P<0.01)。见表2。

表2 不同药物干预后各组 小鼠原位瘤瘤重及抑瘤率

2.2 固本抑瘤Ⅱ号对荷瘤小鼠体重的影响

体重是观察药物疗效的一个重要指标，在给药第7天，各组小鼠体重无明显差异，在给药第14天，中药+阿霉素组小鼠体重较对照组减轻(P<0.05)，在给药第21天和第28天，阿霉素组和中药+阿霉素组小鼠体重均明显低于对照组(P<0.05，P<0.01)，而中药组小鼠体重与对照组相比未见明显差异。见表3。

2.3 固本抑瘤Ⅱ号对小鼠原位瘤体积的影响

在给药前14天，各组原位瘤体积增长均较缓慢，在给药后14天，各组原位瘤体积增长较前变快，以对照组和中药组增速较为明显，中药+阿霉素组增速最为缓慢。 在给药第28天， 中药+阿霉素组小鼠原位瘤体积明显小于对照组(P<0.01)和中药组(P<0.05)。见图1。

表3 不同药物干预后各组小鼠体重变化

注：与对照组比较aP<0.01，与中药组比较bP<0.05。

2.4 固本抑瘤Ⅱ号对RECQL4 mRNA和RECQL4蛋白表达的影响

用Image J软件计算RECQL4蛋白条带的灰度值，可以看出，中药组(P<0.05)、阿霉素组(P<0.01)和中药+阿霉素组(P<0.01)RECQL4蛋白的表达均较对照组降低，而且与对照组相比，阿霉素组(P<0.05)和中药+阿霉素组(P<0.01)也抑制了RECQL4 mRNA的表达(见表4、图2、表5)。

表4 不同药物干预后各组小鼠 原位瘤RECQL4 mRNA表达

注：①对照组；②中药组；③阿霉素组；④中药+阿霉素组。

表5 不同药物干预后各组小鼠原位瘤RECQL4 蛋白表达

3 讨论

虚、毒、瘀是肿瘤发生发展的重要因素，《素问·刺法论篇》云“正气存内，邪不可干”，《素问·评热病论篇》云“邪之所凑，其气必虚”，说明正气存内是机体抗御病邪的防线，正气不足是邪气内侵的基础；癌毒是在脏腑功能失调、气血郁滞的基础上，受内外多种因素诱导而生成，是导致癌病的一类特异性致病因子[11]，也是导致肿瘤发生发展的关键病机；肿瘤属“癥瘕”“积聚”等范畴，血瘀与其关系密切，研究发现肿瘤是一个高度血栓前状态，可以导致血栓栓塞的风险升高4～7倍甚至更高[12]，因此补虚、解毒、化瘀是中药治疗肿瘤的重要法则。郁仁存教授在临床实践中提出了肿瘤的“内虚学说”，后续又发展出“平衡学说”和“气血理论”，在肿瘤治疗方面强调益气活血解毒法的运用，固本抑瘤Ⅱ号即是郁仁存教授基于此创立。

固本抑瘤Ⅱ号包含15味药物，方中生黄芪、党参、茯苓、生白术等益气养血，川芎、鸡血藤、莪术等活血化瘀，肿节风、浙贝母、苦参等解毒散结，扶正与祛邪兼顾，既能提高机体免疫力，又能改善血液高凝状态。同时方中的多种药物均具有抗肿瘤作用，如黄芪中的黄芪多糖可以激活巨噬细胞释放一氧化氮和肿瘤坏死因子α，进而诱导肿瘤细胞凋亡[13]；党参中的多糖CPP1a and CPP1c可以上调Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3，并通过影响肿瘤细胞G2/M时相来抑制肿瘤细胞迁移，促进肿瘤细胞凋亡[14]；茯苓中的茯苓酸可以以浓度和时间依赖性的方式显著抑制细胞增殖并以剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡部分通过PTEN/AKT信号转导和Caspase 3/7活性介导[15]；鸡血藤提取物可以促进肿瘤细胞凋亡和自噬，阻滞细胞周期，抑制肿瘤转移，进而发挥抗肿瘤作用[16]；莪术中的有效成分姜黄素、莪术醇、β-榄香烯等可以通过抑制增殖细胞核抗原Ki-67和PCNA的表达、抑制mTOR信号通路的激活和调控miRNA的表达来抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[17]；女贞子中的提取物齐墩果酸、熊果酸、红景天苷等可以抗诱变，抑制肉瘤、消化系肿瘤、泌尿系肿瘤等多种肿瘤的生长[18]。尽管方中多味中药在实验中均表现出抗肿瘤功效，但单味中药在临床运用和功效发挥方面都具有局限性，难以完全覆盖患者症状，因此中药复方才是当前中医治疗的主要趋势。

阿霉素是原发、复发及转移性乳腺癌的首选化疗药物之一，其属于细胞毒类药物，可作用于肿瘤细胞的DNA。尽管阿霉素在乳腺癌化疗中广泛应用，但其副作用仍无法避免，主要包括疲乏、心脏毒性、肝功能损伤、脱发、皮肤色素沉着等[19-20]，因此，如何减轻阿霉素化疗中的不良反应是临床医生无法逃避的问题，而中药则是解决方法之一。

笔者团队的既往研究发现，在对340例III-IV期肿瘤患者(其中乳腺癌患者105例)的观察中，固本抑瘤Ⅱ号联合化疗能提高治疗有效率 (CR+PR) (34.9%VS27.6%)，改善化疗所致恶心呕吐、腹泻及骨髓抑制(P<0.05)，降低治疗前纤维蛋白原、纤溶酶和血栓素TXB2水平((P<0.01)，减轻患者高凝状态[21]。在基础研究中，固本抑瘤Ⅱ号以剂量依赖性的方式抑制4T1乳腺癌细胞的增殖，可以降低4T1细胞内生长因子(FGF-2和VEGF)的表达，并通过抑制乙酰肝素酶的表达进一步降低丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)的磷酸化[22]，但在疾病相关基因层面的研究尚待深入。

通过UALCAN[23](http://ualcan.path.uab.edu)对TCGA数据库中乳腺癌样本进行生物信息分析发现，与正常组织相比，乳腺癌组织中RECQL4基因表达显著升高(P<0.01)，进一步对RECQL4基因高表达和低表达患者的生存率进行分析发现，尽管两者的生存率没有显著差异，但在五年乃至约近10年生存期内，RECQL4基因高表达的乳腺癌患者生存率低于RECQL4基因低表达患者，提示RECQL4高表达可能是乳腺癌患者的危险因素。此外，Arora Arvind[24]通过对1900多例乳腺癌样本中RECQL4的基因拷贝数、mRNA表达和蛋白质水平的大型队列分析发现RECQL4高表达与侵袭性肿瘤行为显著相关，证实了其对散发性乳腺癌具有肿瘤促进作用，同时RECQL4基因突变也出现在BRCA1和BRCA2阴性的家族性乳腺癌中[25]，因此，RECQL4可能是乳腺癌治疗的一个潜在靶点。

本研究通过体内实验验证了固本抑瘤Ⅱ号、阿霉素及固本抑瘤Ⅱ号联合阿霉素均可对4T1乳腺癌荷瘤小鼠原位瘤产生抑制作用，抑瘤率分别为25.23%、41.44%和59.46%，联合应用的抑瘤效果更加明显，其机制可能与抑制RECQL4蛋白的表达有关。