天祝白牦牛不同时期卵巢中Fas和FasL的表达变化

罗文学,阿依木古丽,韩郁茹

(1.天祝县畜牧技术推广站，甘肃 天祝733299，2.西北民族大学生命科学与工程学院)

1 Fas基因与fasl的关系

Fas基因，又称APO-1、CD95，最早在90年代被迁本(Tsujitomo)发现的促细胞凋亡因子。Fas基因是由编码325个氨基酸组成的蛋白质，为肿瘤坏死基因超家族的成员(TNF-6)。Fas是一种分子质量约为48 ku的I型跨膜蛋白，广泛分布于人和动物机体的各组织中。

FasL，即Fas配体，是Ⅱ跨膜蛋白，相对分子质量约为40 ku。Fas和FasL二者在淋巴细胞的生长、发育、成熟、分化和免疫应答的过程中发挥重要作用。当Fas与FasL结合后，将导致Fas发生寡聚反应，进而引起细胞内死亡诱导信号复合体(DISC)的组装，该复合体通过激活起始caspase引发一系列有关酶的级联反应，最终导致Fas细胞凋亡。目前研究表明Fas和FasL通过介导细胞凋亡在肿瘤发生、自身免疫性疾病和感染性疾病等中起着重要的调控作用。研究表明卵泡闭锁发生于卵泡发育的任何时间内，并且逐步进行，多是相邻囊状较小的卵泡先发生闭锁。Fas作为细胞凋亡基因，探究其在卵巢不同发情周期中的信号转导作用，通过荧光定量RT-PCR技术进行生物学信息分析，为天祝白牦牛卵巢闭锁系统调节机制提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验对象

本实验以健康天祝白牦牛的母牦牛作为实验对象。分别屠宰处于卵泡期、怀(10～30 d)、怀孕(40～60 d)、怀孕(70～90 d)、黄体期、乏情期的健康母牦牛，用无菌手术剪采集卵巢，用液氮保存并带回实验室进行mRNA荧光定量分析实验。

2.2 实验试剂与实验器材

实验试剂：TRIZOL试剂、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(试剂盒组分①5×Reaction Buffer②dNTP Mix(10mmol/L)③Oligo dT Primer(0.5μg/μL)④Random Primer p(dN)6(0.2μg/μL)⑤Rnase lnhibitor(20U/μL)⑥M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)(生工生物工程(上海)股份有限公司)⑦Rnase -free ddH2O)、 氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free ddH2O、琼脂糖、1×TAE、核酸染料。

实验器材：台式高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅、立式高温压力灭菌器、电子秤、电泳系统、凝胶数字成像系统、电泳槽、双人单面循环净化工作台、超低温冰箱、基因扩增仪、移液枪、高压灭菌后的枪头、离心管、涡旋振荡器、PCR管、酒精灯、镊子、制冰机、电泳槽、锥形瓶、量筒等。

2.3 总RNA提取与反转录

将研钵及研钵棒等器材用洗洁精洗净后用蒸馏水冲洗干净，晾干并放入电热恒温干燥箱中280℃、30 min，以除去研钵中的细菌等污染物。此外实验过程中所用到的移液枪枪头、离心管以及PCR管均需于高压蒸汽灭菌锅中121℃、20 min灭菌。当温度降至室温以后，取出实验器材并晾干备用。

2.3.1 根据Trizol提取试剂法的说明书步骤进行操作 (1)将所需要的实验器材和在-70℃冰箱中液氮保存的牦牛子宫组织，放置于超净工作台中。打开紫外灯将超净工作台紫外杀菌15 min然后打开吹风机再用燃烧的酒精棉球消毒台面。双手及袖子喷洒酒精消毒后进入工作区域，将酒精棉球点燃后用镊子夹住，然后擦拭研钵以及钵棒，用以消毒研钵及钵棒。(2)待研钵表面温度与室温相同时，取适量液氮于研钵中，再取样品组织于研钵中，用钵棒迅速研磨。在研磨期间需不断补充液氮，直至组织研磨成白色的粉末状并转移至2 mL离心管中。(3)经液氮研磨后的卵巢组织按50～100 mg组织/mL Trizol提取试剂加入Trizol提取试剂后，室温放置5 min，加200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，转移至离心管。将离心管放入台式高速冷冻离心机中，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(4)取上层清液加入等体积异丙醇，室温静置20 min。再转入台式高速冷冻离心机，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(5)弃去上清液，加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。再离心，12 000 rmp/min，4℃，3 min。(6)弃去上清液后，室温干燥5～10 min。(7)对沉淀进行浓度检测，即采用无RNA酶的DNase Ⅰ(可加入适量加入适量RNA酶抑制剂)处理提取RNA中夹带的DNA。具体操作如下表1所示：将混合物混匀，37℃放置90 min。(8)配制1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶，取(9)中的混合物4 μL，加入加入6×RNA电泳上样缓冲液2 μL混匀，缓冲液2 μL混匀，再加入电泳槽加样孔中。120 V，25 min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。电泳条带可见28S和18S两条明亮条带，则无DNA条带污染。加入30～50 μL RNase-free ddH2O将所得RNA溶解并置于-70℃中保存备用。

表1 RNA浓度检测反应体系

2.3.2 根据生工生物工程(上海)股份有限公司的M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL)的说明书进行操作 (将RNA反转录为cDNA) (1)反应需在冰浴中进行。检查5* Reaction Buffer是否有结晶出现。在无结晶的情况下继续进行如下操作。向试管总分别加入表2中反应物，试剂加入完毕后，用手轻轻混匀，并离心3～5 s。(2)反应混合物在65℃水浴中放置5 min， 然后在试管冰浴的过程中加入如表3中组分，轻轻混匀并离心3～5 s：(3)接着按如下表操作在PCR仪上进行反转录：再冰浴30 s，接着离心3～5 s，冰浴。(4)反转录合成cDNA后，取5 μL反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后再紫外染色。结果呈现出200～10 kb的拖带，则其中心区域在1～4 kb之间，cDNA反转录结果安全。将产物于-20℃保存备用。

表2 反转录反应物

表3 反转录试剂

表4 cDNA的合成

2.4 引物设计与合成

根据NCBI数据库中牦牛(Bos grunniens)β-action(GeneBank登录号：DQ838049.1)、牦牛Fas(GeneBank登录号：JN880421.1)和牦牛FasL(GeneBank登录号：JN880420.1)基因的mRNA序列，采用Primer Primer5.0软件对目的基因进行PCR引物设计并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过β-action作为内参基因来检测天祝白牦牛发情周期不同阶段卵巢Fas的表达变化。引物信息如表5。

表5 引物序列与Real-time PCR反应参数

引物序列及反应条件

2.5 目的基因荧光定量与RT-PCR扩增

荧光定量RT-PR反应体系(25μL)根据SYBR Premax Tag进行操作，反应体系的配制如下。

表6 荧光定量RT-PR反应体系

荧光定量RT-PR反应程序：预变性95.0℃、5 min，变性95.0℃、30 s，退火60℃(Fas)/60℃(FasL)/60℃(β-action)、20 s，延伸72.0℃、30 s，循环40次。分别在每个循环的退火和延伸阶段采集荧光信号数据。待扩增结束后即进行溶解曲线分析，根据所得的溶解曲线判断反应的特异性。再根据每个样品的Ct值，用2-ΔΔCt法计算出目的基因的相对表达量。

2.6 数据分析

每个实验样品需重复3次。系统根据实时荧光定量RT-PR反应结果得出的溶解曲线计算出各个样品中目的基因和内参基因含量的含量，并以同一样品中目标基因的相对和内参基因含量的比值作为目标基因的相对表达量。所得出的实验数据用SPSS 16.0统计分析软件One-way ANOVA进行方差分析以及显著性检验。结果用平均值、标准差表示，P<0.05时表明差异显著，P>0.05时表明差异显著。

3 结果

如图1所示：Fas的表达含量在黄体期最高，其次为卵泡期。怀孕中期Fas表达含量很少，几乎不表达。

图1 Fas的表达含量

如图2所示：FasL的表达含量在黄体期最高，其次为卵泡期。怀孕中后期FasL表达含量较少，但相对于Fas表达量较多。

图2 Fasl的表达含量

4 讨论

天祝白牦牛卵巢主要位于子宫阔韧带前部的卵巢系膜边缘处，为卵圆形的实质性器官。卵巢其形如黄豆，且卵巢门无凹陷。卵巢可分为外周的皮质和中央的髓质。皮质是卵泡发育的场所，故内含有不同发育阶段的卵泡。而髓质中含有丰富的血管和结缔组织，为卵泡的生长发育提供营养物质。卵泡的生长发育过程可分为原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡。在多数情况下，最终能发育到成熟且进入排卵阶段的卵泡在整个卵泡发育体系中只占极少数。卵泡排卵后，卵泡壁塌陷，一方面卵泡壁内膜上的血管破裂出血形成红体，另一方面残留于卵泡内的颗粒细胞和内膜细胞分别形成粒性黄体细胞、膜性黄体细胞，二者均具有分泌功能，分别分泌孕酮和雌激素。卵巢作为内分泌腺，在卵泡期伴随卵泡的发育，雌激素的合成与分泌逐渐增加，其在血液中的浓度逐渐上升，而孕激素相对处于较低水平。排卵后，随着黄体的生成，血液中雌激素浓度下降，而孕激素含量显著升高。在卵泡生长发育过程中，FSH和LH为其主要的蛋白质调节因子，它们通过与受体结合激活cAMP依赖性生理过程，进而促进了粒细胞和壁细胞类固醇激素生成酶的活性，血液和卵泡液中E2的浓度也随之升高。此外卵泡细胞还可生成抑制素、催产素、松弛素活化素等，参与卵泡生长发育的调节。在自然条件下，多数卵泡都会随着发育的进行逐渐退化成为闭锁卵泡，而仅剩余的少数卵泡为优势卵泡。

在天祝白牦牛妊娠早期，其卵巢可分泌颗粒且分泌颗粒可通过胞吐作用释放到卵泡细胞中调节卵泡细胞的生长发育，并与早期妊娠密切相关。伴随着发情周期的延续，卵巢发生周期性的变化。实验结果表明，卵泡期、怀孕期10～90 d、黄体期以及乏情期过程中Fas和FasL均有表达。其中，Fas在黄体期mRNA相对表达含量最高，其次为卵泡期，在怀孕期间Fas的mRNA几乎不表达，之后在乏情期含量显著上升。FasL在黄体期的mRNA相对表达含量最高，在卵泡期的表达量也较高，再次为乏情期和怀孕(10～30 d)，怀孕(40～90 d)mRNA相对表达含量相对较少。但总体来说，天祝白牦牛不同发情周期卵巢FasL的mRNA相对表达含量相对Fas含量较高。表明，Fas和FasL凋亡通路参与调节牦牛卵泡细胞周期性的增值与调节过程，而且在其凋亡途径中主要通过Fas的调控来实现。研究表明子宫内膜雌激素受体αmRNA和孕激素受体mRNA在发情周期后期相对表达含量最强、间情期相对表达含量最弱，雌激素可以降低牦牛子宫内膜细胞中Fas及FasL的表达。本试验中在黄体期Fas和FasL表达显著上升，此时血清雌激素水平降低。研究发现奶牛子宫内膜中ERαRNA和蛋白质都在卵泡期随着血清雌激素水平升高而极显著增加，雌激素可以上调其受体ERα的表达。此外，卵巢的卵泡闭锁在黄体期细胞凋亡显著升高，乏情期卵巢凋亡蛋白相关基因表达量降低，而在发情间期凋亡蛋白几乎不表达。

5 结论

天祝白牦牛不同发周期卵巢中，Fas的相对表达含量在黄体期最高，怀孕期间几乎不表达；FasL的相对表达含量在黄体期表达最高，而在卵泡期，怀孕期间相对表达含量逐渐降低，但表达量高于Fas。