提高PEG诱导鸡血细胞融合率的方法研究

2021-05-14 04:04刘瑞芳陈嘉轩李艾欣
畜牧兽医杂志 2021年6期
关键词:血细胞悬液生理盐水

刘瑞芳,陈嘉轩,李艾欣,孙 喜,吕 立

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西 杨凌 712100)

所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)的作用下,2个或2个以上的异源细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象,又称细胞杂交。体外诱导细胞融合的方法有物理法、化学法和生物法。化学法是利用化学试剂如聚乙二醇、二甲基亚砜、脂质体等改变细胞膜脂质分子排列诱导细胞融合。PEG诱导细胞融合受很多因素的影响,如细胞密度、PEG相对分子质量、PEG的体积分数等。该试验以鸡红血细胞为材料,通过调整鸡红细胞保存液和pH,诣在提高细胞融合率,为PEG诱导细胞融合在本专科实验教学中的应用提供参考依据。

1 试验材料

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 GKN溶液、1%Hanks溶液、50% PEG溶液、抗凝剂、阿氏液(Alsver)、0.85%生理盐水、1%詹那斯绿B溶液。

1.1.2 试验仪器 分析天平(日本岛津有限公司)、低速离心机(湖南湘仪有限公司)、移液器(德国eppendorf有限公司)、恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、光学显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)

2 试验方法

2.1 血细胞悬液的制备

2.1.1 使用Alsver液制备血细胞悬液 鸡翅下静脉采血,将采集的血液注入含有柠檬酸钠的Alsver液中,Alsver液与鸡血按1︰3~1︰4的比例稀释,制成鸡血红细胞储备液。取储备液1 mL,加入4 mL 0.85 %的生理盐水,混匀,1 500 rpm离心5 min, 弃上清液,重复上述操作一次。所得沉淀用4 mL GKN溶液1 000 rpm离心3 min, 弃上清液,再用GKN溶液稀释沉淀,制成血细胞悬液。

2.1.2 使用生理盐水制备血细胞悬液 在肝素钠抗凝采血管中用静脉采血针采血 2~4 mL,轻轻颠倒采血管使血液充分与肝素接触。取 0.5 mL抗凝全血与4.5 mL 0.85%的生理盐水,混匀,1 500 rpm 离心 3 min,弃上清;再重复此步骤一次。所得沉淀用4.5 mL Hanks溶液1 000 rpm离心3 min, 弃上清液,再用Hanks溶液稀释沉淀,制成血细胞悬液。

2.2 PEG诱导血细胞的融合

取1 mL上述细胞悬液于离心管中,加入0.5 mL预热的50% PEG(Mr=4000)溶液, 39℃水浴中进行10 min的细胞融合。然后再加入GKN溶液终止细胞融合,每个水平5个重复。

2.3 血细胞染色及镜检

托底轻摇后,取1小滴悬液于载玻片上,加少量的詹那斯绿B染液,染色5 min左右,在显微镜下观察细胞融合的情况并计数细胞融合率。

2.4 计算细胞融合率

随机选取镜下视野,在每个视野下读取已融合和未融合的细胞数,计算细胞融合率。即:细胞融合率 = 已融合细胞核数 / 总细胞核数×100 %。

2.5 数据分析

每个水平设 5 个重复,分别进行单因素方差分析和双因素方差分析,以P<0.05 为差异显著,P>0.05为差异极显著。

3 结果与分析

3.1 不同血细胞保存方法对细胞融合率的影响

从表1中发现,利用肝素钠抗凝采血管抗凝后的鸡全血经0.85%生理盐水处理后,在4℃冰箱保存1周后,细胞膜完整,细胞核清晰,形态规则,稳定性良好,细胞的融合率稳定,随着保存时间的延长,细胞的融合率没有明显变化。而使用Alsver液处理的血细胞,保存时间不超过24 h,随着保存时间的延长,细胞的融合率明显降低。

表1 不同血细胞保存方法对细胞融合率的影响

3.2 不同pH对细胞融合率的影响

从表2可看出, 随着pH值的改变,细胞融合率呈现先升高后降低的趋势。pH为8时细胞融合率显著高于pH为6.5、8.5和9.0(P<0.05),与pH值为7.0和7.5时细胞融合率差异不显著(P>0.05),即pH值为6.5的酸性条件下,细胞的融合率最低,而pH为8时细胞的融合率最高。

4 讨论

4.1 不同血细胞保存方法对细胞融合率的影响

Alsever液主要由柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠和葡萄糖组成,具有一定的抗凝血作用,也是一种等渗平衡的血细胞保存液。抗凝剂的一些成分与血液中的Ca2+形成难解离的可溶性络合物,势必导致血液中的Ca2+浓度降低。大量研究表明,血液中高Ca2+能够促进和提高细胞融合率。本实验使用Alsever液制备血细胞悬液组的细胞融合率显著低于肝素钠制备组,与前人的研究结果一致,可能是Alsever液的抗凝血作用直接导致Ca2+浓度降低,从而造成细胞融合率下降所致。生理盐水处理组更有利于延长血细胞的保存时间,且不影响血细胞的融合率。

4.2 不同pH对细胞融合率的影响

从实验结果发现,pH 是影响细胞融合率的关键因素之一,这与前人的研究结果一致。偏酸性条件下融合效率较低,当 pH=7~8时,细胞融合率有明显升高的趋势,说明弱碱性环境可促进细胞聚集接触、引起磷脂双分子层疏松重排,提高细胞的融合率。可能原因一可能是 pH对 PEG 活性产生了影响,原因二可能是 pH 对融合细胞自身产生了影响。当pH=8.5~9.0时细胞的融合率又出现下降趋势,表明强碱性条件不利于细胞融合。

5 结论

在本科实验教学时,选择适宜观察的有核红细胞、便于操作的 50%浓度 的PEG为实验材料;利用肝素类抗凝管采集血液,且 4℃保存细胞稳定性好;全血与洗涤液和缓冲试剂按 1∶10 比例、pH为 8.0时进行融合的细胞融合率最高。

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