柑橘木虱对12种寄主植物嫩梢及其挥发物成分的趋性反应

汤夏安，李贤良，池章辰，韦舒蔚，邓业成*，邓志勇，骆海玉，邓明学

(1. 广西师范大学生命科学学院，珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林 541004；>2. 广西特色作物研究院，广西 桂林 541004)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama属半翅目扁木虱科，是柑橘黄龙病自然传播的主要虫媒。柑橘黄龙病是一种分布广泛的对柑橘产业造成严重威胁的病害(王国平等，2007)，其病原为韧皮部杆菌CandidatusLiberibacteria asiaticus。由于该韧皮部杆菌目前尚无法人工培养，所以对柑橘黄龙病的病理和防治研究进展十分缓慢。目前对柑橘黄龙病的防治研究主要集中在对柑橘木虱的防控上，而对柑橘木虱的防治以化学手段为主。但长期使用化学药剂不仅对果园生态系统造成严重破坏，而且还会带来农药残留和木虱抗药性等问题(邓明学等，2012；田发军等，2018)。面对不断肆虐的柑橘黄龙病问题，研究柑橘木虱的绿色防控技术显得十分重要和迫切。

现行的柑橘木虱绿色防控措施以物理手段为主，物理防控手段当中以黄板诱杀较为流行(邓明学等，2010)。在黄板诱集柑橘木虱的过程中也会带来一些负面影响，有研究表明有很大数量的昆虫具有趋黄性，在果园中采取黄板诱杀柑橘木虱的过程中会诱捕到大量的柑橘木虱天敌昆虫，从而一定程度上损害了果园生态系统(毛润乾等，2014)。还有研究表明昆虫的视觉作用范围十分有限，因此超过一定距离色板可能无法对该区域的木虱起到诱集效果。此外黄板诱集柑橘木虱的效果还受黄板的间距、高度和方向是否合适等因素的影响(赵政等，2018)。因此在田间使用黄板诱集柑橘木虱的效果并不理想。

植食性昆虫可通过对植物挥发性气体的辨别来对寄主植物进行准确的定向和定位。柑橘木虱具有发达的嗅觉系统，有研究表明柑橘木虱触角上分布有多种嗅觉受体，可使柑橘木虱触角嗅觉神经元对月桂烯和丁酸乙酯等多种化合物产生强烈的电生理反应(Coutinhoabreuetal.，2014)。通过对柑橘木虱具有引诱活性的化合物的筛选,从而开发针对柑橘木虱的植物源引诱剂已成为柑橘木虱防控的一个重要研究方向。已有研究结果显示寄主植物嫩梢挥发物中几种萜类物质对柑橘木虱具有明显的吸引作用(Pattt&Sétamou，2010)。还有研究者通过对九里香挥发物进行分析研究，筛选出一种对柑橘木虱具有较强引诱效果的混剂(宋晓兵等，2019)。由于柑橘木虱专性取食芸香科植物，又由于同科植物的亲缘关系相近，所以推测芸香科植物中所含的共同挥发物成分有可能对柑桔木虱具有引诱作用。本文对柑橘木虱寄主植物挥发物共同成分进行分析并从中找出对柑橘木虱具有引诱活性的共同成分，旨在为柑橘木虱引诱剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫及植物：柑橘木虱成虫采自广西桂林市临桂区灌塘村5年生柠檬园，将虫子从野外带回在实验室半年生砂糖橘幼苗上进行饲养。2 d后挑选健康的柑橘木虱进行试验。供试植物九里香Murrayaexotica、HB柚Citusgrandis‘HB’、红肉酸柚Citusgrandis‘Hongrousuan You’、沙田柚Citusmaxima‘Shatian You’、高斑柚Citusgrandis‘gaoban You’、纽荷尔脐橙Citussinensis‘Newhall’、香水柠檬Citruslimon‘Xiangshui’、酸橙Citrusaurantium、夏橙Citrussinensis、温州蜜柑Citrusreticulata‘Unshiu’、贡柑Citrusreticulata‘gonggan’、沃柑Citrusreiculata‘Orah’嫩梢，均采自广西特色作物研究院柑橘研究所柑橘种质园。

标准品：96% α-石竹烯、98% (-)-β-石竹烯、96% 萜品油烯、97% 芳樟醇、99% α蒎烯、96 % 3-蒈烯，美国Sigma-Aldrich公司；99% D-柠檬烯、95% γ-松油烯，TCI公司；90% 液体石蜡油，希恩思公司。

仪器：自制Y型嗅觉仪，Y型管直臂长13 cm，两侧臂长8 cm,夹角75°，各臂内径均为1.5 cm。两侧臂末端分别连接一内径5 cm的陷阱球。Y型管两测臂末端依次用Teflion(聚四氟乙烯)管连接流量计、500 mL味源瓶、250 mL空气加湿瓶、1 L活性碳干燥塔以及吹气泵，Y型嗅觉仪各器皿均由透明玻璃制成；Agilent 7890A-5975C气-质谱联用仪(GC-MS)，Agilent公司；固相微萃取(SPME)手柄，Supleco公司；DVB/CAR/PDMS，50/30 μm SPME萃取头，安谱实验科技股份有限公司；ACO-001型电磁式吹气泵，饶平县兴成机电水族用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1柑橘木虱对12种寄主植物嫩梢趋性行为测定

参考吴国强等(2012)和唐良德等(2015)的方法并进行适当改进，利用Y型嗅觉仪测定柑橘木虱成虫对12种寄主植物嫩梢的趋性。Y型管两侧臂空气流速均控制在100 mL/min，试验温度为25±2℃，试验时间为8 ∶30-19 ∶30，味源分别为九里香、红肉酸柚、HB柚、沙田柚、高斑柚、纽荷尔脐橙、香水柠檬、酸橙、夏橙、温州蜜柑、贡柑和沃柑的嫩梢。取100 g供试植物嫩梢置于味源瓶中，以洁净的空气作为对照。每次试验从Y型管直臂末端接入单头柑橘木虱成虫，雌雄随机。当试虫接入Y型管后进行计时，试虫进入陷阱球并在其中持续时间超过1 min，记为选择；5 min内未做出选择的，记为无反应。每试验5头柑橘木虱后调换两侧臂的位置。每试验10头柑橘木虱后用95%乙醇清洗Y型管并吹干待用，更换另一只干净的Y型管继续试验。每种嫩梢试验测试柑橘木虱成虫20头，每种处理重复3次。统计做出选择的柑橘木虱成虫虫数计算选择率，嫩梢选择率(%)=对味源嫩梢做出选择的柑橘木虱数量/有反应的木虱数量×100，对照选择率(%)=对对照做出选择的柑橘木虱数量/有反应的木虱数量×100。

1.2.26种柑橘木虱寄主植物嫩梢挥发物共同组分分析鉴定

选择九里香、纽荷尔脐橙、HB柚、高斑柚、红肉酸柚和沙田柚等6种对柑橘木虱具有较好引诱活性植物的嫩梢，利用SPME与GC-MS法对嫩梢挥发物共同组分进行分析鉴定。取100 g洁净的嫩梢于250 mL锥形瓶中并用锡箔纸覆盖锥形瓶口，再用封口胶封住锡箔纸。将锥形瓶置于25±2℃的采样室内进行气味平衡30 min，然后采用SPME萃取头顶空萃取2 h。萃取结束后立刻将萃取头插入GC-MS进样口进样。GC色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气；载气流速0.1 mL/min；进样口温度为250℃；无分流进样；升温程序为40℃保持3 min，以3℃/min升至160℃保持2 min，然后以8℃/min升至220℃保持3 min。MS为EI源电离；电离能为70 eV；离子源温度为230℃；四级杆温度150℃；扫描范围为50～550 amu。通过GC-MS机载(NIST08)谱库检索匹配分析组分的质谱数据，并参考结合标准图谱对化合物进行鉴定。采用归一化法计算各组分相对含量。

1.2.3柑橘木虱对寄主植物嫩梢挥发物成分的趋性测定

利用Y型嗅觉仪测定柑橘木虱对8种寄主植物嫩梢共同组分的趋性。试验方法同1.2.1所述，不同的是将味源瓶中嫩梢改为由石蜡油稀释成10、1、0.01、0.001 μL/mL的8种挥发物成分供试液，将20 μL供试液滴加至2.0 cm×1.5 cm的滤纸上置于味源瓶中作为味源，以20 μL石蜡油作为对照。每种处理试验测试柑橘木虱成虫20头，每种处理重复3次。统计做出选择的柑橘木虱成虫虫数计算选择率，选择率(%)=对味源做出选择的柑橘木虱数量/有反应的木虱数量×100。

1.3 数据分析

利用SPSS 19.0，采用t检验法对选择率进行差异显著性检验，采用单因素方差分析对柑橘木虱对不同挥发物标准品在不同浓度下的选择率进行分析。

2 结果与分析

2.1 柑橘木虱对12种寄主植物嫩梢的趋性反应

利用Y型嗅觉仪测定柑橘木虱对12种植物嫩梢趋性反应，结果如表1所示，柑橘木虱对九里香、沙田柚、红肉酸柚、HB柚、高斑柚和纽荷尔脐橙嫩梢的选择率分别为66.70%、66.04%、63.77%、63.86%、61.67%和60.35%，相对于对照选择率差异极显著(P<0.01)；对香水柠檬和沃柑嫩梢的选择率为57.82%和58.60%，相对于对照选择率差异显著(P<0.05)；对酸橙、夏橙、温州蜜柑和贡柑的选择率分别为53.51%、55.46%、54.30%和55.37%，相对于对照选择率差异不显著(P<0.05)。以上结果显示九里香、沙田柚、红肉酸柚、HB柚、高斑柚和纽荷尔脐橙等6种植物嫩梢对柑橘木虱成虫拥有较好的引诱活性，这也表明这6种植物嫩梢挥发物中可能存在对柑橘木虱具有较好引诱活性的物质，所以选择这6种植物的嫩梢进行下一步挥发物成分分析试验。

表1 柑橘木虱对12种寄主植物嫩梢的选择反应

2.2 6种寄主植物嫩梢挥发物的共同组分

利用SPME与GC-MS联用法分别对6种植物嫩梢挥发物成分进行分析鉴定，从6种植物嫩梢挥发物中鉴定出醇类、脂类、烯烃类、酮类和醛类等5类物质。其中共鉴定出8种嫩梢挥发物共同组分，分别为γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、a-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-柠檬烯和芳樟醇，以上8种物质及其在6种植物嫩梢挥发物中的相对含量见表2。这几种挥发物在不同植物嫩梢挥发物中的相对含量不尽相同，其中γ-松油烯在6种植物挥发物中相对含量为8.23%～35.80%，3-蒈烯的相对含量为4.13%～10.03%，萜品油烯的相对含量为1.25%～15.53%，(-)-β-石竹烯的相对含量为0.03%～5.22%，a-石竹烯的相对含量为0.60%～1.72%，(+)-α-蒎烯的相对含量为1.72%～13.89%，芳樟醇的相对含量为0.29%～2.64%，D-柠檬烯的相对含量为 2.18%～14.95%。这些挥发物共同组分在不同植物嫩梢挥发物中的相对含量不同可能与不同嫩梢所表现出的不同柑橘木虱引诱活性相联系。结合相关文献笔者推测在这8种挥发物共同组分中可能存在对柑橘木虱成虫具有引诱活性的物质，遂购买这8种挥发物共同组分的标准品进行柑橘木虱成虫引诱试验。

表2 8种植物嫩梢挥发物共同组分相对含量

2.3 柑橘木虱对寄主植物嫩梢挥发物共同组分的趋性反应

不同浓度的嫩梢挥发物标准品对柑橘木虱成虫的引诱活性试验结果见表3。由表3可以看出8种嫩梢挥发物标准品在0.01、0.1、1和10 μL/mL 4个浓度下对柑橘木虱成虫均有一定的引诱活性。其中柑橘木虱对(-)-β-石竹烯的选择率随人工合成单品浓度的增加而逐渐增大，在10 μL/mL浓度时对(-)-β-石竹烯选择率最大达73.2%；柑橘木虱对芳樟醇的选择率随其浓度的增加先逐渐增大后降低,在1 μL/mL时达到最大值79.19%；柑橘木虱对γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、α-石竹烯、(+)-α-蒎烯以及D-柠檬烯纯品的选择率与纯品浓度没有明显的相关性，在试验浓度下选择率最高分别达到64.45%、65.64%、69.17%、60.17%、67.91、60.17%和71.88%。

表3 不同浓度挥发物纯品对柑橘木虱成虫的引诱活性

3 结论与讨论

植食性昆虫对寄主植物的选择存在较大差异，王少丽等(2011)测定了朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus对不同蔬菜寄主的取食选择性，发现朱砂叶螨最喜食菜豆，其次为茄子、番茄和黄瓜，相对不喜欢取食辣椒。植食性昆虫对同种寄主植物的不同部位的喜爱也存在较大差异，魏智娟(2008)通过观察对比假眼小绿叶蝉Empoascavitis对茶树不同叶片的取食选择性，发现假眼小绿叶蝉成虫喜欢在茶树第三叶到第六叶上取食，第三叶到第六叶的落虫数与第一、第八叶落虫数差异显著。柑橘木虱对寄主植物不同部位的取食选择也具有明显的差异，相对于寄主植物的其他部位,其对寄主植物的嫩梢具有明显的偏好性(许鑫，2018)。有研究发现柑橘木虱对柑橘属植物以及九里香属的九里香表现出明显的偏爱(姚廷山等，2018)。植物释放出的挥发性物质是昆虫对寄主选择的重要刺激信号，马铃薯挥发性物质中的反式-2-己烯醛和顺式-3-乙酸叶醇脂等化合物可吸引马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Dickens，2001)。为明确柑橘木虱寄主植物挥发物对柑橘木虱的引诱作用，本试验选择12种柑橘木虱寄主植物的嫩梢作为试验材料，通过生物测定发现柑橘木虱对不同寄主植物嫩梢表现出不同强度的趋向性，其对沙田柚、九里香、纽荷尔脐橙、HB柚、高斑柚、红肉酸柚等6种植物嫩梢表现出较好的趋性。之后选择以上6种对柑橘木虱具有较好引诱活性的寄主植物嫩梢为材料，利用SPME与GC-MS技术联用对这6种嫩梢挥发物成分进行提取、分离和鉴定以明确柑橘木虱寄主植物挥发物中共同组分，从中共鉴定出8种挥发物共同组分分别为γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、α-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-柠檬烯以及芳樟醇。有研究者从九里香、砂糖橘、沙田柚、尤力克柠檬、红肉脐橙、沙田柚以及黄皮嫩梢挥发物中鉴定出α-石竹烯、(-)-β-石竹烯、β-罗勒烯和β-榄香烯等共4种共同组分(高传贺，2016)，除α-石竹烯和(-)-β-石竹烯外本研究在九里香、HB柚、沙田柚和红肉酸柚嫩梢挥发物中也鉴定出了β-罗勒烯，但未在纽荷尔脐橙和高斑柚嫩梢挥发物中鉴定出；在九里香、HB柚、高斑柚和沙田柚嫩梢挥发物中鉴定出β-榄香烯，但未在纽荷尔脐橙和红肉酸柚嫩梢挥发物中鉴定出。还有研究结果显示九里香和柠檬挥发物的主要成分是β-罗勒烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯和(-)-β-石竹烯(Pattt&Sétamou，2010)，本研究也从九里香挥发物中鉴定到了以上4种挥发物成分。植物挥发物成分组成受生理因素的影响很大，在不同时间段存在较大差异。薛丹等(2012)对早、中和晚3个时间段的大栀花香气成分进行分析后发现这3个时间段内大栀花香气成分的种类以及含量都存在较大差异。马艳等(2019)对不同危害条件下山核桃CaryacathayensisSarg.挥发物进行分析后发现在不同星天牛危害下的山核桃挥发物存在差异，并且星天牛对不同危害下的山核桃挥发物的反应也存在一定差异，对蒎烯、罗勒烯、对二乙苯、萜品烯、壬醛、α-萜品醇、五甲基苯、丙烯酸-2-乙基己酯、2,6-二甲基萘以及正十六烷10种挥发物产生显著的触角电位反应，对其他挥发物成分无反应。本研究对部分柑橘木虱寄主嫩梢挥发物的鉴定结果与前人试验结果存在一定差异，这些差异可能是由于试验时间以及试验材料的状态差异造成的，但具体原因还需进一步研究分析。

昆虫对不同信息化合物有着不同的反应阈值(Dickens，1984)，不同的挥发物气味对柑橘木虱的影响在特定浓度下才能起到作用。有研究表明α-石竹烯和(-)-β-石竹烯分别在1和0.1、10 μL/mL 对柑橘木虱具有一定的引诱活性(高传贺，2016)。本文通过测定柑橘木虱对8种挥发物标准品的趋性发现8种挥发物标准品在4个试验浓度下均对柑橘木虱具有一定的引诱活性，其中(-)-β-石竹烯、D-柠檬烯以及芳樟醇对柑橘木虱的引诱活性最好，(-)-β-石竹烯、D-柠檬烯在浓度为10 μL/mL时引诱率达到最高73.2%和71.88%，芳樟醇在浓度为1 μL/mL时引诱率引诱率达到79.19%。昆虫对寄主植物的定位受寄主植物挥发物所调控，而寄主植物挥发物是由多个活性成分以特定比例混合而成的混合物(Nojimaetal.，2003；Bruceetal.，2005；Tasinetal.，2007)。有学者将萜品油烯、(+)-α-蒎烯和芳樟醇按照2 ∶ 8 ∶3 的比例进行混配，得到一种柑橘木虱的引诱剂，其田间引诱木虱数量比液体石蜡油对照提高49.3倍(岑伊静等，2014)。还有学者利用α-石竹烯、萜品油烯以及石油醚按照体积比3 ∶3 ∶4进行混配，研发出了一种柑橘木虱引诱剂(王永模和刘慧，2013)。本研究结果表明γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、a-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-柠檬烯以及芳樟醇等8种物质在不同浓度下对柑橘木虱均有一定的引诱活性，研究结果为进一步混配筛选柑橘木虱高效引诱剂以及柑橘木虱绿色防控技术的研究提供了一定参考。