基于铕螯合物纳米粒子标记的时间分辨荧光免疫法检测嗜水气单胞菌

丁箫月，冯建军，辛甜甜，郭松林，王艺磊，林 鹏

(集美大学水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门 361021)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)可引发人类和哺乳动物败血症等疾病[1,2]，日本鳗鲡败血腹水病、体表溃疡病和肠炎病均与嗜水气单胞菌感染有关[3,4]，因此，建立嗜水气单胞菌检测技术可有效预防和控制病害发生，减小病害造成的损失。酶联免疫吸附法(ELISA)[5]和荧光免疫抗体法[6]检测嗜水气单胞菌已有报道，但ELISA法如果没有生物素-链霉亲和素的信号放大作用，其检测限只有4.0×105CFU/mL，而荧光抗体法只是采用荧光显微镜半定量观察，灵敏度更低。时间分辨荧光免疫检测(Time -Resolved Fluorimmunoassay,TRFIA)以稀土螯合物作为标记物，而稀土螯合物的荧光寿命较长，免疫反应后，延缓测量时间，待短寿命的背景荧光完全衰变后再测量螯合物的荧光[7，8]，灵敏度比ELISA法和荧光抗体法高约两个数量级。我们曾应用解离增强TRFIA法检测水产养殖病原菌[9]，但该方法是用本身没有荧光的标记物标记抗体。标记物本身即是荧光团，反应后不需要解离显色的稀土螯合物探针已见诸于报道[10,11]，但另一种荧光标记物更具有优势，即荧光纳米粒子[12,13]。用于TRFIA的标记粒子是纳米级的聚苯乙烯微粒共价包埋多个稀土螯合物分子[14]，由于纳米粒子表面修饰有羧基、氨基等功能性基团，可以用来偶联蛋白抗体进行标记。用稀土螯合物纳米粒子作为标记物已在TRFIA检测中得到应用[15,16]，主要用于可溶性小分子物质，但用于颗粒性的病原菌检测尚未见报道。

在本文中，我们将铕螯合物纳米粒子标记在嗜水气单胞菌抗体上，采用双抗夹心TRFIA法，建立了一种检测嗜水气单胞菌的新方法。结果证明纳米粒子标记的TRFIA法同样可用于颗粒性病原菌检测。该方法线性范围宽，检测限为1.0×103CFU/mL，远高于ELISA法及荧光抗体法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Perkins-Elmer Victor X4多标记分析仪(美国，Perkins-Elmer公司)；GE Healthcare SPA亲和层析柱(美国，GE Healthcare公司)。

羧基修饰的铕螯合物荧光纳米粒子(Fluoro-Max)购自美国Thermo fisher scientific公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(Sulfo-NHS)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)购自美国Pierce公司，其他相关试剂均为国产分析纯。菌株B15获得于病变的日本鳗鲡，并经Biolog自动生化鉴定系统(GeneⅢ)鉴定为嗜水气单胞菌；实验用鳗鲡购自福建莆田养殖场；兔抗嗜水气单胞菌抗体(IgG)据文献方法[17]制得，其效价为1∶25 600。

1.2 实验方法

1.2.1 IgG的纳米粒子标记参照纳米粒子标记说明书以及文献报道[18]，向离心管中加入20 μL纳米粒子和180 μL MES缓冲液(pH=6.0，0.05 mol/L)，混合均匀后加入4 μL EDC溶液(0.1 mol/L)，迅速加入10 μL Sulfo-NHS溶液(0.05 mol/L)，室温反应15 min，加入0.28 μL巯基乙醇，室温反应10 min。4 ℃ 离心35 min(15 000 r/min)，去除上清液，加入200 μL 磷酸盐缓冲液(pH=7.5，0.1 mol/L)溶解的IgG抗体，反应2 h后离心去除上清液。加入20%BSA封闭液200 μL，离心去上清后，用200 μL含有SDS的去离子水洗涤标记纳米粒子三次，最后复溶于200 μL 0.05 mol/L MES缓冲液，得纳米粒子-IgG溶液，4 ℃保存备用。标记效果亦根据文献方法[18]验证，效果良好。

1.2.2 菌株B15的纳米粒子TRFIA法检测用0.05 mol/L，pH=9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释IgG，每孔加入100 μL稀释后的IgG到96孔微孔板中，包被12 h，包被温度37 ℃，用0.05 mol/L Tris-HCl洗涤液(pH=7.8)洗涤3次，加入3%BSA 200 μL封闭2 h，封闭温度37 ℃，洗涤液洗涤3次，加入分析缓冲液稀释的不同浓度嗜水气单胞菌B15菌悬液100 μL，振动孵育1 h，孵育温度37 ℃，洗涤液洗涤3次后，加入工作浓度的纳米粒子-IgG溶液，振动孵育后再用洗涤液冲洗6次，多标记分析仪上测量时间分辨荧光(TRF)，测量参数设置如下：激发波长340 nm，发射波长615 nm，延迟时间0.4 ms，测量时间0.4 ms。样品孔的TRF值设为P，对照孔的TRF值设为N，P/N>2时判断为阳性，其中对照孔以分析缓冲溶液代替B15菌株。

2 结果与讨论

2.1 正交试验设计及结果分析

以P/N值为指标，抗体包被时间(A)、抗体包被浓度(B)、纳米粒子-IgG的免疫反应时间(C)、纳米粒子-IgG稀释度(D)为4个因素，选择3个水平进行L9(34)正交试验，因素水平列于表1。

表1 正交试验设计

正交试验结果如表2所示，K1、K2和K3表示每个因素在三个水平下对应P/N值的和，k1、k2和k3则代表

表2 试验方案和结果

(续表2)

三个水平所对应P/N值的平均值，R为极差，即该因素k值的极大值与极小值之差，k值越大，表示该水平的P/N值越大，水平越优，R值越大，表示该因素对P/N值的影响越大。因此，根据表2极差分析结果可知，因素A影响结果最大，D次之，因素B和C的影响结果相对较小，四个因素的影响程度依次为抗体包被时间>纳米粒子-IgG稀释度>纳米粒子-IgG的免疫时间>抗体包被浓度。由k值可以得出最优组合为A2B1C2D2，即12 h抗体包被时间，0.5 μg/mL抗体包被浓度，3 h免疫时间为和1∶4 000 的纳米粒子-IgG稀释度。

图1 正交试验的结果验证Fig.1 Verification of orthogonal experimental results

2.2 正交试验结果验证

正交试验得出的最优组合为A2B1C2D2，但是该组合并未出现在所做9次的正交试验设计中，为了验证结果的准确性，在正交试验设计的9次组合基础上，加上该组合，一起重新进行基于纳米粒子标记的TFRIA法检测菌株B15，结果示于图1。第10组的组合为A2B1C2D2，其P/N值最大，正交试验确实对结果的优化具有一定的指导意义，并且可以降低筛选成本，提高筛选效率。

2.3 延迟时间的选择

一般镧系元素螯合物的荧光衰变时间约为0.9 ms，其它荧光团的衰变时间为1～100 μs，生物样品中背景荧光的衰变时间只有1～10 μs[19]。为此我们考察了延迟时间在0.1～0.6 ms的TRF，发现延迟时间在0.2～0.4 ms时，TRF值最大且基本不变，因此选择延迟时间为0.4 ms。延迟时间过短，会导致干扰荧光进入检测器影响测定，延迟时间过长，由于镧系元素螯合物荧光也会衰变，导致TRF减小。

2.4 重复性实验

固定嗜水气单胞菌浓度，采用正交试验筛选的最优条件，随机在同一微孔板上进行纳米粒子TRFIA测定，计算平均值与标准偏差(板内变异系数=板内标准偏差/平均值×100%)。同理，在6块微孔板上进行纳米粒子TRFIA测定，计算板间变异系数[20]。得出菌株B15检测的板内变异系数为2.70%，板间变异系数为9.62%。说明该方法稳定性好，重现性高。

2.5 特异性实验

我们采用嗜水气单胞菌菌株B15的抗体与其它14种病原菌菌株(包含不同血清型的嗜水气单胞菌菌株)，进行基于铕螯合物纳米粒子标记的TRFIA检测，并同时进行菌株B15的检测，结果见表3。嗜水气单胞菌抗体与菌株B15有较强的阳性反应，其P/N为22.95，而与其它致病菌菌株无交叉反应，检测结果为阴性，说明抗体特异性良好，其它菌株并不干扰B15的检测。

2.6 工作曲线及检测限

利用建立的纳米粒子标记TRFIA法检测不同浓度菌株B15，其TRF值随致病菌浓度的增高而增大。分别以时间分辨荧光的对数值lgTRF为纵坐标、细菌浓度的对数值lgCFU为横坐标，绘制标准曲线，线性范围1.0×103～1.0×108CFU/mL，相关系数R2=0.990，以P/N>2时所对应的最小浓度为检测限，其检测限为1.0×103CFU/mL，远高于ELISA[5]及法荧光抗体法[6]，相较于已经报道的解离增强TRFIA法检测病原菌[9]，由于标记物为荧光纳米颗粒，灵敏度也提高了5倍。

表3 纳米粒子TRFIA测定嗜水气单胞菌抗体的交叉反应

2.7 鳗鲡的实际样品检测

以腹腔注射嗜水气单胞菌的日本鳗鲡组织样品作为实验组，腹腔注射生理盐水的鳗鲡组织样品作为对照组，建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA法检测嗜水气单胞菌，以实验组的TRF值与对照组的TRF值比值大于2(即P/N>2)时判断为阳性。针对25个包括肝、鳃、肾、肠、肌组织在内的样品进行了测定，结果见图2，样品均呈阳性，检出率达100%，高于ELISA法(图3，84%)。

图2 鳗鲡样品纳米粒子TRFIA法检测结果(1～5分别代表五条感染后的鳗鲡)Fig.2 The results of detection of A.japonica samples using nanoparticle-TRFIA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

图3 鳗鲡ELISA法样品检测结果(1～5分别代表五条感染后的鳗鲡)Fig.3 The results of detection of A.japonica samples using ELISA(Number 1-5 represent the five infected A.japonica)

3 结论

建立了基于铕螯合物纳米粒子标记的TRFIA新方法检测嗜水气单胞菌，方法的检出限提高到1.0×103CFU/mL，高于ELISA法和荧光抗体法，相较于解离增强TRFIA法，灵敏度也得到了进一步提高。检测了25份人工感染的日本鳗鲡样品，包括鳃、肾、肠、肝和肌肉组织，结果满意。纳米粒子标记TRTIA法检测病原菌，在水产养殖病害防治领域有着广阔的应用前景。