头部电针对脑梗死大鼠尿液代谢组学影响的研究*

路思宇，王东岩，杨海永，麻聪聪，陈 崇，赵亚楠

(1．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2．黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脑卒中是全球范围内引起死亡和残疾的主要原因。我国中风发病率因人口老龄化的加剧逐年升高，其中，缺血性卒中，即脑梗死，占70%以上[1]。随着脑卒中防治手段的逐步发展，脑梗死的死亡率已有所下降。然因其残存神经功能缺损患者的数量仍居高不下，致使患者因肢体和心理障碍难以适应并回归社会，对患者及其家庭产生巨大负担。寻找有效的治疗方法是脑梗死一项亟待解决的问题。目前，临床上治疗脑梗死主要通过药物(包括溶栓治疗)、针灸和推拿等中医疗法以及康复治疗、手术等。电针作为脑缺血的有效治疗手法，已得到学者们的广泛证实[2-3]，但其具体的治疗机制尚未阐明。代谢组学是研究生命系统被干扰后(如病理生理刺激或基因改变)其代谢产物的种类、数量与其变化规律的一门跨领域学科[4]。代谢组学通过对生物样本中代谢产物的快速、全面分析来阐明其生理或病理途径[5]。与基因组、转录组或蛋白质组的底物不同，代谢组的产物包含了大量化学性质不同的化合物，如氨基酸、神经递质、盐、酸和脂类等[6]。这使得代谢组学可以采用自上而下的策略，从代谢网络的最终产物反映生物体的功能，并从整体的角度理解外在干预对于整个系统的代谢造成的影响。这种性质与中医的整体观念相互契合，对于中医证候、预防医学、疗效评价和针灸等循证医学的科学表达提供了良好契机[7]。代谢组学也可以通过分析代谢紊乱和脑梗死之间的内在联系，得出脑梗死的相关代谢产物及通路，进而揭示其致病的内在靶点。

本实验采用超高效液相色谱与四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对MCAO模型大鼠尿液进行非靶向代谢组学研究，探究脑梗死大鼠尿液中代谢标志物的变化。并通过对标志物代谢通路的分析，探究电针治疗脑梗死的作用靶点和代谢途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 实验试剂与仪器

乙腈(德国Merck公司);甲醇(Sigma公司);乙酸铵(Sigma公司);AB Triple TOF 5600/6600质谱仪(美国Waters公司);Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(美国Waters公司);ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(美国Waters公司);低温高速离心机(德国Eppendorf公司);生物机能实验系统BL-420F(成都泰盟软件有限公司);电子天平(德国Siemens公司);针灸针(贵州安迪药械有限公司);MCAO栓线2432-A4(北京百农科技有限公司)。

1.3 实验分组

造模前2周进行大鼠的左前肢抓取预训练，每日1次，每次20 min[8]。将36只大鼠随机分为3组：空白组、模型组和电针组，每组各12只。

1.4 造模

运用线栓法制备大脑中动脉梗阻(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型。先进行称重，后采用100 g/L水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，将颈部正中部位剃毛并消毒，开长度约1～2 cm的切口，逐层剥离，轻轻撕开动脉鞘，分离右侧颈总、颈内和颈外动脉，于血管分叉近端结扎颈外动脉，远端结扎颈总动脉，在分叉处下方夹闭，于下方开一切口，缓慢插入栓线并固定，去动脉夹，使栓线进入颈内动脉至约18 mm，固定并减除多余结扎线，冲洗切口缝合并消毒[9]。将术后大鼠放置于环境清洁舒适的鼠笼内，于白炽灯下加热保暖，在2 h后评估是否造模成功[10]。

1.5 电针治疗方法

选取百会穴(两耳尖连线与头正中线相交处)、前神聪穴(两耳尖连线与头正中线相交处前5 mm)[11]，针刺时向病灶侧透刺15 mm，频率刺激器选择连续波，刺激频率2 Hz，电流1 mA，每日1次，每次20 min，连续治疗14 d。其余各组与电针组同一时间进行绑缚。

1.6 行为学评分

1.6.1 Zea-Longa评分 大鼠苏醒后2 h采用Zea-Longa评分[12]对其神经功能缺损情况进行评价，大鼠得分越高神经功能缺损越严重。排除0分和4分的大鼠，将1～3分大鼠纳入后续实验。见表1。

表1 Zea-Longa评分

1.6.2 Ludmila Belayev评分 采用Ludmila Belayev 12分评分法[13]，分别在治疗后1 d、3 d、5 d、7 d和14 d对大鼠进行神经功能缺损评分。Ludmila Belayev 评分法包括姿势反射实验和肢体放置实验两部分。

1.6.2.1 姿势反射测验 0:无明显神经功能缺失；1:梗死对侧肢体屈曲；2:侧推试验阳性。

妈妈印象最深刻的就是吃红薯，她告诉我，早上吃的是“整猪整羊”，意思是光吃蒸红薯，中午是“芝麻拌糖”，意思是在饭上蒸一点红薯，晚上则是“吹吹打打”，吃的是煨红薯，需要拍灰吹打……

1.6.2.2 肢体放置试验 包括视觉亚实验、触觉亚实验和本体觉亚实验。视觉亚实验：即前方刺激，实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近(此时桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反应为前肢即刻抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0:动物肢体放置反应正常；1:反应延迟但不超过2 s；2:反应延迟且超过2s。侧方刺激，此时桌子位于动物侧方，其余实验方法及评分标准同前方刺激。触觉亚实验：将动物双眼遮住，并使其前爪悬空，此时大鼠既看不见，也不能用胡须触及桌面，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达皮肤和毛发。动物反应及评分同视觉亚实验，触觉刺激同样分前方及侧方刺激。本体觉亚实验：操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同。本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节。该亚实验只有前方刺激。

1.7 尿液样品收集与制备

治疗14 d后，收集空白组、假手术组和电针组大鼠尿液各1 mL，3 000 r/min离心10 min后取上清液0.5 mL，储存于-80℃中备用。从-80℃中取出样本，于4℃中缓慢溶解，分别取各组样本100 μL，加入400 μL预冷的甲醇乙腈溶液(1∶1)，涡旋60 s，-20℃放置1 h沉淀蛋白，14 000 rcf，4℃离心20 min，取上清冷冻干燥，进行UPLC/MS分析。

1.8 色谱质谱条件

1.8.1 色谱 色谱柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)柱温为25℃，流速为0.3 mL/min。流动相由A(水+25 mM乙酸铵+25 mM氨水)和B(乙腈)组成。梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B从95%线性变化至65 %；7～8 min，B从65%线性变化至40%；8～9 min，B维持在40%；9～9.1 min，B从40%线性变化至95%；9.1～12 min，B维持在95%。整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。

1.8.2 质谱 在电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式下进行质谱分析。ESI源条件：Ion Source Gas1(Gas1): 40, Ion Source Gas2(Gas2): 80, Curtain gas(CUR): 30, source temperature: 650℃，正负两种离子模式IonSapary Voltage Floating (ISVF)±5000 V；样本的二级质谱通过高灵敏度数据相关采集模式获取，正负两种模式去簇电压：±60 V，碰撞能量：(35±15)eV，数据相关采集设置为排除4 Da内的同位素，每循环监测候选10个离子。数据采集是按Mass Range进行分段，50～300，290～600，590～900，890～1 200，从而扩大二级谱图的采集率，每个方法每段采集4个重复。

1.9 数据处理和统计分析

首先将原始数据通过ProteoWizard转换为通用数据格式(mzXML)文件，然后采用XCMS程序(http://metlin.scripps.edu/download/)对代谢物离子峰进行提取、检测和对齐，得出可视化数据矩阵，包括样品名称、保留时间、m/z和峰面积。采用SIMCA软件(v.12.0)对上述数据进行无监督主成分分析(PCA)，有监督偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多维统计分析。再采用SPSS 25.0 软件进行单变量统计分析。根据从UPLC-Q/TOF-MS获取的总离子流色谱图(Total ion chromatogram, TIC)得到分子质量，结合MS/MS信息，在人类代谢组学数据库(Human Metabolome Database, HMDB) (http://www.hmdb.ca/)及KEGG数据库(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行检索和比较分析。

2 结果

2.1 电针对大鼠行为学的影响

造模后各时间点，与空白组比较，模型组和电针组评分均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。随着模型组缺血时间的延长，评分逐渐下降，表明脑缺血具有一定程度的自愈能力。造模后第1、3天，与模型组比较，电针组评分无显著改变，差异无统计学意义(P>0.05)；造模后第5、7、14 天，与模型组比较，电针组评分显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。此表明随着缺血时间的延长，模型组神经功能改善不明显，而电针组在5 d后显著好转。见表2、图1。

表2 各组大鼠Ludmila Belayev评分的比较

图1 电针对脑梗死大鼠行为学影响变化示意图

2.2 大鼠尿液代谢组学结果分析

2.2.1 实验结果质量控制 各组大鼠尿液样本通过UHPLC-Q-TOF MS处理分析后，得到每个样品的质谱图，通过对质谱图离子的重叠比较，得出各组样品的总离子流谱图(TIC)。其中横坐标表示时间，纵坐标表示离子强度值。结果显示，正负离子模式下大鼠各组尿液样本中各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明实验过程中仪器导致的误差较小，数据可靠。见图2。

图2 正负离子模式尿液QC样本总离子流图

2.2.2 总体样本主成分分析 采用XCMS软件对正负离子模式下尿液代谢物的离子峰进行提取，将所有尿液样本和QC样本所提取得到的峰经过Pareto-scaling软件处理得到总体样本的PCA模型。通过主成分分析可知，各组之间有分离趋势，空白组与模型组沿t[2]轴分离，说明两组尿液的代谢物之间存在一定差异。而电针组分布基本介于空白组与模型组之间，说明电针治疗可以发生代谢物的改变，且有回调的趋势。见图3。

注：uB：空白组;uC：模型组;uD：电针组。

2.2.3 空白组与模型组的尿液代谢物比较 比较空白组与模型组尿液样本的PLS-DA得分图，结果显示正离子模式下R2Ycum=0.906，Q2cum=0.629，负离子模式下R2Ycum=0.923，Q2cum=0.605，两组样本分别组内聚拢，组间明显分离，表明模型稳定可靠。通过对数据的进一步分析，比较空白组与模型组两组尿液样本OPLS-DA的得分图，结果显示正离子模式下R2Ycum=0.906，Q2cum=0.655；负离子模式下R2Ycum=0.923，Q2cum=0.628，以两组代谢样本的主成分作为参考， 空白组与模型组组内聚集，组间沿t0[1]轴明显分离，两组尿液样本中代谢产物存在显著性差异，能够被明显区分，说明MCAO损伤导致大鼠体内代谢功能紊乱，尿液中代谢物的含量发生改变。见图4～5。

注：uB：空白组;uC：模型组。

注：图uB：空白组;uC：模型组。

2.2.4 模型组与电针组的尿液代谢物比较 比较模型组与电针组尿液样本的PLS-DA得分图，结果显示正离子模式下R2Ycum=0.874，Q2cum=0.533，负离子模式下R2Ycum=0.874，Q2cum=0.537，表明模型稳定可靠，但组间分离不够明显，所以通过OPLS-DA对数据进行进一步分析。比较模型组与电针组两组尿液样本OPLS-DA的得分图，结果显示正离子模式下R2Ycum=0.814，Q2cum=0.599；负离子模式下R2Ycum=0.814，Q2cum=0.577，以两组代谢样本的主成分作为参考，模型组与电针组组内聚集，组间沿t0[1]轴明显分离，两组尿液样本中代谢产物存在显著性差异，能够被明显区分，说明电针治疗导致大鼠体内代谢功能和代谢物的含量发生改变。见图6～7。

注：uC：模型组;uD：电针组。

注：uC：模型组;uD：电针组。

2.2.5 差异代谢物和代谢途径的筛选 通过空白组与模型组间筛选出具有的差异代谢物，进一步通过多维统计分析VIP>1与单变量统计分析P value<0.05作为筛选标准，筛选出MCAO模型大鼠尿液差异代谢标志物95个，其中，上调的有65个，下调的有30个。再对电针组与模型组的代谢物进行筛选，并结合MCAO模型组大鼠差异代谢物的信息，筛选出电针干预后回调的代谢物39个，其中上调的代谢物有11个，下调的代谢物有28个。差异代谢物基本信息见表3。

通过比较分析空白组与模型组、模型组与电针组大鼠尿液的差异代谢物，发现回调的39个差异代谢物主要参与脑组织的能量代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和神经递质代谢等。通过KEGG数据库分析这些代谢物主要参与的代谢通路有柠檬酸循环、精氨酸代谢、嘌呤代谢、谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢及神经递质代谢等。

3 讨论

头部腧穴是脑缺血临床治疗中的常用穴、首选穴。本研究选取百会穴、前神聪穴进行治疗，百会穴位于督脉，《难经》曰其为“阳脉之海”。《会元针灸学》曰：“百会者，五脏六腑奇经三阳百脉之所会，故名百会。”前神聪穴为四神聪穴之一，是经外奇穴，其与百会同位于巅顶，可“清利头目，醒脑开窍”。两穴又均位于脑部，脑为“髓海”“元神之府”。因此，针刺百会、前神聪穴可通阳助阳、益气生髓。从解剖的角度看，百会穴为顶中线与顶颞后斜线的起点，前神聪穴为顶颞前斜线的起点，顶颞前斜线与顶颞后斜线为大脑皮层顶叶与颞叶的投影区，顶颞前斜线对应中央前回司运动，顶颞后斜线对应中央后回司感觉，针刺此区域可能促进大脑中动脉供血，达到激发患者感觉、运动中枢功能的目的。

表3 各组间尿液差异代谢物基本信息

电针组在治疗后行为学评分明显优于模型组，说明电针治疗对脑梗死大鼠具有显著疗效。通过代谢组学的检测方法，进一步比较了各组间的差异代谢物及代谢途径。经研究发现，大鼠脑梗死后，代谢物质的改变可以通过电针治疗发生回调，使疾病病程发生改变，达到康复的目的。

3.1 能量代谢

正常情况下大鼠脑组织的能量代谢主要为有氧代谢，在有氧条件下糖酵解生成的丙酮酸在线粒体内发生三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA)生成CO2。当脑梗死发生时，由于脑供血受阻，TCA因底物缺乏而受到抑制，导致能量合成受阻[14]，糖酵解生成的丙酮酸发生氧化磷酸化，在乳酸脱氢酶的作用下形成乳酸(DL-lactate)[15-16]。通过对比,空白组与模型组大鼠体内尿液代谢物，发现模型组乳酸水平较空白组明显升高，说明脑梗死后脑组织能量供应发生改变，有氧糖酵解减少，无氧糖酵解增加。电针组尿液中的乳酸水平较模型组显著下降，说明电针干预能够改善脑组织TCA循环的能量供应模式，促进脑梗死后脑组织的能量供应，使糖酵解模式发生转变，这可能是由于电针促进脑组织血流、加快缺血区的血液供应所导致的。苹果酸(Citramalic acid)为TCA 循环的中间产物，神经胶质细胞中含有苹果酸脱氢酶，一部分丙酮酸能够通过苹果酸代谢进行供能[17]，苹果酸的含量在模型组中显著降低，电针组中明显回调，提示苹果酸对脑梗死大鼠具有一定的脑保护作用。

3.2 氨基酸代谢

氨基酸是人体代谢的重要能量来源，一般在体内具有两个代谢途径。一条途径为合成生物体特有的蛋白质、多肽或其它含氮物质。另一条途径通过脱氨、转氨或脱羧作用被水解生成α-酮酸、胺类及二氧化碳。脑梗死后大鼠血清代谢物中大量氨基酸含量发生改变，模型组与空白组相比，3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、N-乙酰基-L-天冬氨酸(N-Acetyl-L-aspartic acid)、左旋瓜氨酸(L-Citrulline)、赖氨酸-亮氨酸(Lys-Leu)、NG, NG-二甲基-L-精氨酸(ADMA)[G,NG-dimethyl-L-arginine(ADMA)]和苯丙氨酸-脯氨酸(Phe-Pro)含量升高，N-乙酰-L-谷氨酸(N-Acetyl-L-glutamate)、N6-甲基-L-赖氨酸(N6-Methyl-L-lysine)和N-乙酰基-L-组氨酸(N-Acetyl-L-Histidine)等氨基酸含量降低。模型组和电针组相比，上述氨基酸均发生回调。谷氨酸和天冬氨酸为兴奋性氨基酸，是导致缺血性卒中发生的关键化合物，它参与缺血脑组织细胞的级联反应，并影响缺血神经元的坏死与凋亡。空白组与模型组相比，模型大鼠尿液代谢物中谷氨酸和天冬氨酸含量明显升高，而电针组谷氨酸和天冬氨酸的含量发生回调。苯丙氨酸是生物体合成蛋白质的主要物质来源，水解能够产生延胡索酸参与TCA循环[18]。本研究发现尿液样本中空白组苯丙氨酸的相对含量较模型组明显升高，且电针组与模型组相比出现回调，说明苯丙氨酸代谢可能在脑梗死过程中发挥重要作用。

3.3 脂质代谢

花生四烯酸是脂肪酸的代谢产物，它能诱导内皮细胞和平滑肌细胞产生IL-6，并导致神经系统疾病炎症反应[19]。脑梗死后脑血管的通透性增加，引起炎症介质释放、组织水肿，炎症介质刺激激活细胞膜上的磷脂酶，导致甘油磷脂发生水解反应产生溶血卵磷脂及花生四烯酸等代谢产物。脑缺血引起脑组织中脂肪酸代谢紊乱，造成脑组织中ATP合成障碍、消耗增加，引起花生四烯酸的代谢紊乱。电针干预后，大鼠尿液中的鞘磷脂(Sphingomyelin)、磷酸胆碱(Phosphorylcholine)的含量发生回调。多种胆碱代谢物含量也出现回调，说明电针干预能够促进脑梗死大鼠脂质代谢趋于正常。

本实验选取大鼠尿液为研究样本因其是生物整体代谢网络的最终产物，能够从宏观角度集中把握病理生理过程对生物体产生的影响，也恰好与“整体观念”的思想相契合，且尿液取样方便、安全无创，是基础研究中良好的体液标本。综上所述，头部电针对脑梗死大鼠神经功能恢复具有明显的促进作用，其机制可能与电针调控三羧酸循环、氨基酸代谢和花生四烯酸代谢等途径有关，为电针治疗脑梗死作用靶点的研究提供实验依据。但电针治疗脑梗死的具体机制还未完全阐明，尿液代谢物样本也存在一定的不稳定性，有待通过其它方法进一步研究。