miR-133b、miR-495在骨肉瘤组织中表达的临床意义及相关性分析

李名武，王勤志，孙法瑞

(鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院 创伤骨科，湖北 黄石 435000)

骨肉瘤是骨骼系统的常见恶性肿瘤，恶性程度高，早期可发生转移，预后较差。相关报道显示转移、复发骨肉瘤患者5年总体生存率不到20%[1]。微小RNA(micro RNA，miRNA)在恶性肿瘤中发挥致癌基因或抑癌基因作用[2]。miR-133b是一种抑癌基因，通过调节抑制肿瘤生长、转移、侵袭相关基因或蛋白表达抑制肿瘤进展[3]。miR-495可调控免疫反应、炎症反应、骨细胞分化、骨代谢等，在多种恶性肿瘤中亦发挥抑癌基因作用[4]。本研究拟通过检测骨肉瘤患者瘤组织中miR-133b、miR-495表达，探讨其与骨肉瘤病理特征和预后的关系，旨在为临床诊治、病情和预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年8月～2019年8月黄石市中心医院肿瘤外科收治的79例行手术治疗的骨肉瘤患者为研究对象，纳入标准：①典型骨骼、关节疼痛，局部有肿块，关节活动受限，经术后病理诊断为骨肉瘤；②行手术治疗，术前未接受放化疗、生物治疗；③骨肉瘤组织标本保存完好。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②恶性肿瘤骨转移者；③风湿或类风湿性关节炎、骨外伤、骨结核等其他骨骼疾病；④随访失联者。男49例，女30例，年龄17～39岁，平均(24.56±5.19)岁；肿瘤部位：股骨远端26例，胫骨近端21例，肱骨近端19例，其他13例。肿瘤直径2～7 cm，平均(4.62±2.35)cm；Enneking分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期30例，Ⅲ期28例；淋巴结转移35例，远处转移19例。以手术切除的骨肉瘤组织为骨肉瘤组，以距离瘤组织>5 cm的组织为对照组。本研究通过书面申请并获得我院伦理委员会批准。

1.2 方法 取骨肉瘤组及对照组组织液氮冷冻标本，先置于2～8℃冰箱使之溶解，后置于室温下使之全溶，组织研磨仪研磨后离心1 min，加入裂解液充分混匀，采用TRIzol试剂(美国Ambio 公司)提取总RNA，采用CFX96实时荧光PCR 仪(美国Bio-Rad公司)M-MLV 逆转录酶(Epicentre 公司)进行实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)将总RNA转录为cDNA。反转录体系共18 μL，包括RNA 模板5 μL，1 μL OligodT，反转录酶(50 U/μL)1 μL，RNA酶抑制剂(20 U/μL)0.5 μL，dNTPs(100 mmol/L)1 μL，buffer液1.5 μL，DEPC水5 μL，U6及miRNA引物3 μL。引物合成及序列测定由上海基康公司完成，序列如下，miR-133b上游引物：5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′，miR-495上游引物：5′-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：95℃ 10 s，65℃ 20 s;75℃ 15 s，共40个循环。扩增条件：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，45个循环，共做3 次平行试验。以U6为内参，2-ΔΔCt法计算miR-133b、miR-495表达水平。

1.3 随访 所有患者均定期接受电话随访和门诊复查，电话随访每3个月1次，统计患者随访期间生存情况，所有患者随访至2020年8月。门诊复查内容包括病变部位X线片、骨扫描、淋巴结B超等，评估有无复发和淋巴结转移。

2 结果

2.1 骨肉瘤组、对照组miR-133b、miR-495表达比较 骨肉瘤组中miR-133b、miR-495表达均低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 骨肉瘤组、对照组miR-133b、miR-495表达

2.2 不同临床病理参数骨肉瘤患者miR-133b、miR-495表达比较 Enneking分期 Ⅲ期、淋巴结转移、远处转移患者骨肉瘤组织中miR-133b、miR-495表达低于Enneking分期Ⅰ期、Ⅱ期，未发生淋巴结转移和远处转移患者(P<0.05)，Enneking分期Ⅰ期、Ⅱ期之间miR-133b、miR-495表达差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径之间miR-133b、miR-495表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同临床病理参数骨肉瘤患者miR-133b、miR-495表达

2.3 不同miR-133b、miR-495表达骨肉瘤患者生存差异 所有患者随访截止2020年8月，中位随访15(12～36)个月，随访期间死亡36例。根据骨肉瘤组miR-133b、miR-495表达均数将患者分为高miR-133b表达组(miR-133b≥0.33，26例)、低miR-133b表达组(miR-133b<0.33，53例)、高miR-495表达组(miR-495≥0.43，29例)、低miR-495表达组(miR-495<0.43，50例)。制作生存曲线(图1)，经Log-Rank检验低miR-133b表达组骨肉瘤患者生存率为49.06%(26/53)，低于高miR-133b表达组的65.38%(17/26)(Log-Rankχ2=5.900，P=0.015)，低miR-495表达组骨肉瘤患者生存率为44.00%(22/50)，低于高miR-495表达组的72.41%(21/29)(Log-Rankχ2=5.342，P=0.021)。

图1 不同miR-133b、miR-495表达骨肉瘤患者生存曲线

2.4 影响骨肉瘤患者预后的Cox回归分析 以骨肉瘤患者随访期间是否死亡为因变量，纳入年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、Enneking分期、淋巴转移、远处转移、miR-133b、miR-495为自变量。单因素Cox风险比例回归分析显示肿瘤直径、Enneking分期、淋巴转移、远处转移、miR-133b、miR-495与骨肉瘤患者死亡有关(P<0.05)。多因素Cox风险比例回归分析显示淋巴转移、远处转移、低表达miR-133b、miR-495是骨肉瘤患者死亡的危险因素(P<0.001)，见表3、4。

表3 影响骨肉瘤患者预后的单因素Cox回归分析

表4 影响骨肉瘤患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

骨肉瘤是一种高度恶性和侵袭性骨肿瘤，约15%～20%患者在确诊时已发现有肺转移，仅20%～30%的患者可长期存活[5]。尽管临床治疗手段不断改进，患者生存率有所提高，但是复发、转移患者生存率仍较低，预后非常差[6]。miRNA 是一类非编码小分子RNA，参与细胞生长、分化、增殖、凋亡等病理生理行为过程，与恶性肿瘤发生发展密切相关，现有研究显示多种miRNA参与骨肉瘤发生和发展[7]。

miR-133b是一种典型的肌肉特异性miRNA，在哺乳动物骨骼、心肌细胞发育中具有重要的作用[8]，miR-133b可通过阻断细胞周期，促使凋亡相关基因和蛋白表达诱导细胞凋亡[9]，并通过抑制靶向基质金属蛋白酶、肌束素结合蛋白1或肿瘤细胞上皮间质转化降低癌细胞侵袭和迁移[10]，在胃癌、肺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中扮演抑癌基因角色[11]。本研究发现骨肉瘤组织中miR-133b低表达是骨肉瘤患者预后不良的危险因素之一，miR-133b参与骨肉瘤发病、病情进展的机制为：①Kruppel 样因子4(Kruppel like factor 4，KLF-4)通过促使血管生成、细胞增殖分化参与骨肉瘤细胞侵袭转移，miR-133b可抑制KLF-4表达，进而抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移[12]；②miR-133b还可直接靶向成纤维细胞生长因子受体1[14]或通过Wnt/catenin信号通路靶向抑制Sirt1表达[13]，降低肿瘤细胞活力，抑制骨肉瘤细胞生长、侵袭和迁移。

miR-495是新发现的抑癌基因，具有调节细胞增殖凋亡、免疫炎症反应、骨细胞分化等作用[14]。越来越多证据表明miR-495异常表达与多种恶性肿瘤进展有关，miR-495通过胰岛素样生长因子-1 /AKT信号轴调控口腔鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化[15]；还可通过上皮和内皮酪氨酸激酶促使上皮-间充质转化诱导小细胞肺癌对化疗产生耐药性[16]。本研究发现miR-495表达降低与骨肉瘤恶性进展行为和不良预后有关，分析机制为：首先，高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)是miR-495调控靶点，其通过上调细胞周期蛋白表达促使肿瘤细胞增殖，并通过MAPK信号通路促进间质上皮转化[17]。miR-495靶向抑制HMGA2抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移[18]。其次，C1q/ TNF相关蛋白3 (C1q/TNF-related protein 3，CTRP3)作为miR-495靶点负调控破骨细胞形成，miR-495通过抑制CTRP3表达抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[19]。

综上所述，骨肉瘤组织中miR-133b、miR-495表达均降低，miR-133b、miR-495低表达与骨肉瘤发生、恶性进展和不良预后密切相关。miR-133b、miR-495有望成为骨肉瘤诊断、预后评估的生物学指标。