外周血中ABCC3 浓度与CYP2C19 基因型对PCI 术后 氯吡格雷抗血小板效应的影响

王晶晶，郭晓波，谢 娟，阮芙蓉

（西安交通大学医学院附属西安市中心医院，1.药剂科，2.血液科，西安 710003）

冠心病临床常见的心血管疾病之一，也是导致死亡的主要原因之一［1］。经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）已经成为治疗冠心病的主要方法之一。氯吡格雷（clopidogrel）作为新型的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受体拮抗剂，是PCI 术后患者的抗血小板治疗的一线用药，但氯吡格雷临床应用的个体差异较大，有4～30%的患者常规服用时，不能有效地使其转化成活性产物［2］，氯吡格雷抵抗的出现已影响其疗效发挥，为此导致了血栓形成、死亡等心血管缺血事件。

在体内，约15%的氯吡格雷原药经CYP2C19 催化生成活性代谢物，进而发挥药理活性，CYP2C19 基因多态性与药物的代谢及疗效密切相关［3］，能够影响药物在体内的代谢过程及药效的发挥。目前主要开展针对药物代谢酶CYP2C19 基因型检测来诊断患者氯吡格雷抵抗的发生率［4-6］，但进行CYP2C19 基因型检测费用高，检测时间长，步骤复杂，部分患者对该项检测项目接受度不高，间接影响其预后。因此，有必要寻找一种新的用于诊断PCI 术后患者氯吡格雷敏感性的方法。有研究发现外周血ABCC3 中较低水平的mRNA 与氯吡格雷的增敏效应有关［17］。本课题将探究分析ABCC3与CYP2C19 基因型的相关性，外周血ABCC3 表达水平与CYP2C19 基因型分别对氯吡格雷抗血小板效应的关系，，以为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择在2017 年1 月～2018 年1 月期间于本院进行诊断为冠心病并进行PCI 手术的患者103 例，男63 例，女40 例，记录患者基本信息如年龄、性别、体重指数、吸烟史、疾病史等。

纳入标准：（1）PCI 术后接受氯吡格雷继进行抗血小板治疗；（2）年龄＞18 岁。

排除标准：（1）具有出血倾向，不能用药者；（2）妊娠期妇女患者；（3）肿瘤及其他心血管病患者；（4）肝肾功能异常患者；（5）不能接受随访患者。本研究方案经医院医学伦理委员会批准，所有患者或其家属均知情同意且签署知情同意书。

1.2 治疗方法 入选的冠心病患者行PCI 术后，采用阿司匹林联合氯吡格雷抗血小板治疗，负荷剂量300 mg，维持剂量75 mg／d，用药时间至少半年。

1.3 CYP2C19 基因型检测 采集所有患者的外周静脉血4 mL，通过DNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司）提取全血基因组DNA，经DNA PCR 扩增，进行杂交显色，采用DNA 微阵列芯片法检测相应的CYP2C19 等位基因。

1.4 外周血ABCC3 水平检测 采用人ABCC3 ELISA检测试剂盒（美国BioLegend 公司）对外周血浆中的ABCC3 进行测定，利用抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记反应原理。酶标仪测定450 nm OD 值，利用标准曲线进行分析测定。

1.5 观察指标 分别于PCI 术前及PCI 术后7 d 抽取患者空腹肘静脉血3 mL，采用比浊法测定ADP 诱导的血小板聚集率；观察血小板聚集率变化及达标率（5mol /L ADP 诱导的血小板聚集率＜50%）。

1.6 统计分析 本实验数据由IBM SPSS Statistics 22.0 统计分析。基因型分布由χ2检验分析是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，以P＞0.05 视为符合Hardy-Weinberg 平衡。计量资料mean±SD 表示，采用单因素方差分析；计数资料以百分比（或例数）表示，采用卡方检验统计分析。线性回归采用GraphPad 7 进行统计分析。P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本资料 本研究共纳入接受PCI 手术治疗且接受氯吡格雷抗血小板治疗的ACS 患者103例，其中男63 例，女40 例，年龄（62.4±12.6）岁，其中单支血管病变43 例，两支血管病变35 例，三支血管病变25 例，合并原发性高血压（高血压）42 例，合并2 型糖尿病31 例，吸烟患者43 例。

2.2 CYP2C19 等位基因型分析 对80 例患者进行CYP2C19 等位基因分析，经χ2检验所有基因型均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05）。根据CYP2C19 对氯吡格雷代谢的影响分为以下3组：快代谢型（CYP2C19*1/*1 基因型）、中代谢型（CYP2C19*1/*2，CYP2C19*1/*3 基因型）、慢代谢型（CYP2C19*2/*2，CYP2C19*2/*3，CYP2C19*3/*3 基因型），中慢代谢型患者占63%，其构成比见图1，及各基因型占比见图2。

图1 CYP2C19代谢效率基因型构成比

图2 CYP2C19基因型构成比图

2.3 不同CYP2C19 基因型患者外周血ABCC3 水平利用ELISA 方法检测外周血中的ABCC3 水平，测定103 例PCI 术后服用氯吡格雷治疗的患者外周血中ABCC3 水平为32.6±6.2 ng/mL。对比不同代谢水平的CYP2C19 基因型患者的ABCC3 表达水平，发现在快代谢型患者中的ABCC3 水平为26.4±7.1 ng/mL，较中代谢型患者（35.3±5.8 ng/mL）及慢代谢型患者（40.1±6.7）显著降低，比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。中代谢型患者的ABCC3 水平也显著低于慢代谢型患者（P＜0.05）。

表1 不同CYP2C19基因型患者外周血ABCC3水平

2.4 CYP2C19 基因型对抗血小板聚效应的影响 PCI术后采用氯吡格雷治疗，不同CYP2C19 基因型患者的血小板聚集率及达标率进行分析，CYP2C19 快代谢型患者的血小板聚集率较中、慢代谢型患者显著降低（P＜0.05），且快代谢型患者的达标率高于中、慢代谢型患者（P＜0.05），见表2。尽管中代谢型患者的血小板聚集率较慢代谢型低，但差异无统计学意义。

表2 CYP2C19基因型对抗血小板聚效应的影响

2.5 外周血ABCC3 水平对血小板聚集率的影响 利用线性回归分析外周血ABCC3 水平与血小板聚集率的相关性，见图3，可见在103 例患者中外周血ABCC3的浓度与血小板聚集率呈显著正相关（R2=0.5512，P＜0.001），说明ABCC3 水平与氯吡格雷的抗血小板疗效呈负相关。

图3 外周血ABCC3浓度与血小板聚集率的相关性图

3 讨论

经皮冠状动脉介入（PCI）已经成为治疗冠心病的主要方法之一。由于PCI 治疗中对病变斑块的挤压、促凝组织的暴露以及支架等器械置入等可促进血小板激活、血栓形成，引发支架内血栓，导致心肌梗死和死亡等恶性临床事件，故患者在PCI 治疗后需进行抗血小板治疗。氯吡格雷是当前经皮冠状动脉介入术后预防血栓事件的常规策略［7，8］。据文献报道，有4～30% 的患者存在不同程度的氯吡格雷抵抗［2，9］，其不良临床事件的发生率较氯吡格雷敏感者升高。

大多数相关文献指出，存在CYP2C19* 2 基因变异的患者，其对于氯吡格雷的代谢较低［4，10］，携带CYP2C19* 2 功能缺失基因的人群在使用氯吡格雷的效果显著低于不携带该基因型的人群。国内既往研究也发现，急性冠脉综合征患者PCI 术后CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因变异氯吡格雷抵抗发生率更高，支架内血栓及心血管不良事件发生率明显升高［3，5，6］。也有研究发现，经皮冠状动脉介入治疗后相关的血小板反应与CYP2C19 酶活性的变化相关［11］。本研究结果也发现，在CYP2C19 快代谢型患者中，氯吡格雷的抗血小板疗效显著高于中、慢代谢型患者。

ABCC3 是ABC 转运体家族的重要成员，它扮演内源性葡萄糖醛酸及其偶联物在外排中的重要作用跨细胞膜的药物代谢物［12］。ABCC3 被证明与肿瘤的多药耐药现象有关［13-15］，其参与多种肿瘤的增殖、侵袭，可能通过外排抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的药物浓度导致耐药的产生。研究发现人血小板中可检测到ABCC3 mRNA 和蛋白的表达，推测ABCC3 和其他ABC 转运体可能影响药物在血小板上的转运［16］。本研究中，发现在CYP2C19 快代谢型患者中ABCC3 的表达量较低，而其抗血小板疗效较好，说明CYP2C19 与ABCC3 的表达具有相关性。同时也发现在低表达量ABCC3 的患者中，氯吡格雷的抗血小板疗效较好。在103 例患者中，对ABCC3 的表达量与血小板聚集率进行相关性分析，也发现其强正相关性联系。说明ABCC3 可能通过调控氯吡格雷的代谢或影响其作用靶点，进而影响其疗效。Luchessi 等发现，外周血细胞中低ABCC3 mRNA 表达与氯吡格雷增敏有关，但需要进一步的研究其具体机制［17］。

本研究发现ABCC3 的低水平表达与氯吡格雷的增敏效果有关，且与CYP2C19 基因型具有相关性，提示ABCC3 可作为PCI 术后氯吡格雷抗血小板效应的重要指标。