针灸“肺俞”“大椎”“风门”对哮喘模型大鼠肺组织STAT6、血清IL-13表达的影响

徐宁，邵素菊，华金双，王培育，张君，任重，胡晓京，田丽

(1.河南省中医院，河南 郑州 450002; 2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008)

支气管哮喘是临床常见的慢性呼吸道疾病之一，是由多种细胞和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病[1]。临床症状常表现为反复发作性的气急、喘息、胸闷或咳嗽等，在夜间或清晨最为多发[2]。哮喘的发生与气道壁Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的激活密切相关。白介素-13(IL-13)是引起哮喘患者气道炎症发生和发展的重要炎症因子[3]，其诱导过敏反应是通过嗜酸粒细胞、IgE介导的反应[4]。STAT6作为信号转导和转录激活因子，参与细胞增殖、分化、迁移等多个过程，是哮喘发生发展过程中的重要转录激活因子[5]。本实验所选腧穴肺俞、大椎、风门是国家名老中医邵经明教授经过几十年的临床及实验研究总结出来的治疗哮喘的经验有效穴，该穴组经过大量实验研究，已证实其可以缓解气道炎症，降低气道高反应性，改善气道重塑，其治疗哮喘是通过多途径、多靶点实现的[6-7]。IL-13及STAT6 mRNA参与了多种气道炎症，在哮喘中发挥着重要作用，本实验通过观察针灸对哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺组织STAT6 mRNA表达的影响，探讨“邵氏五针法”改善哮喘症状及治疗哮喘的作用机制，为针灸治疗哮喘提供更为科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取成年雄性SPF级SD大鼠40只，体质量160～180 g。购买后在通风良好、适宜的温度和湿度环境中分笼适应性饲养5 d后，根据计算机随机数字表随机分为空白组10只、模型组10只、针刺组10只和艾灸组10只。

1.2 主要试剂与仪器

卵蛋白(美国Sigma公司)；31号一次性毫针(0.30 mm×13 mm,中研太和)；细艾条(0.7 cm×10 cm南阳汉医艾绒有限责任公司)；IL-13 ELISA检测试剂盒(CK-E30477R)；切片机(德国徕卡公司)；彩色图像分析系统(西安华海电子有限公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：CX21)；雾化器(辽宁省鞍山无线电一厂)；RT-PCR试剂盒(TransgelCHINA)；β-actin引物(赛百盛)；荧光定量PCR仪(ABI7500 Applied Biosystems)。

1.3 模型制备

参照《肺脏免疫学及免疫相关性疾病》[8]造模方法，建立大鼠哮喘模型。

在实验的第1天和第8天分别对各组大鼠以10%的卵蛋白溶液进行腹腔注射1 mL，空白组用0.9%生理盐水代替，进行致敏。在实验第15天取1%的卵蛋白溶液由超声雾化器雾化20 min，进行激发，每日1次，连续激发7 d。以大鼠出现呼吸急促喘息，节律加快或不齐，反应迟钝，毛色失去光泽，大便不调为造模成功。

1.4 治疗方法

针刺组：从实验第15天起，选用一次性毫针(0.30 mm×13 mm)，“肺俞”(双)直刺6 mm，“大椎”直刺5 mm，“风门”(双)直刺6 mm，三穴均采用平补平泻法，每次留针20 min，留针期间每10 min行针1次，起针后激发，每天1次，共针刺7次。穴位定位参照《实验针灸学》。

艾灸组:从实验第15天起，将艾条点燃后，在距离“肺俞”(双)皮肤上方2～3 cm施行温和灸、在距离“大椎”“风门”(双)皮肤上方2～3 cm施行回旋灸，每次灸10 min，每天灸1次，灸毕进行激发，共灸7次。

空白组和模型组：不做任何治疗，只给予如针刺、艾灸组相同抓握刺激。

1.5 标本取材

末次激发24 h内大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)，待大鼠麻醉后，打开腹腔，取腹主动脉血5 mL，以3 000 r/min，离心30 min,取上层血清，-20 ℃冰箱保存,ELISA待测。

打开胸腔暴露肺及心脏，即刻取右肺中下叶(包括肺门)，用4 ℃生理盐水将其漂洗干净后，立即放入新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蜡包埋，肺组织病理切片待测。

取右肺下叶组织，黄豆粒大小，用4 ℃生理盐水漂洗血迹，放入DEPC处理过的2 mL冻存管内，投入液氮罐保存，RT-PCR待测。

1.6 指标检测

切片肺组织进行HE染色；IL-13进行ELISA检测；STAT6进行RT-PCR检测，操作均严格按照试剂盒说明进行。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 行为和体征

空白组：大鼠呼吸平稳，反应灵敏，毛色光泽，饮食、二便正常。模型组：激发后大鼠呼吸急促、喘息、抓耳挠腮，连续激发后毛色干枯、脱落，反应迟钝，行动迟缓，饮食减少，大便不调。针刺组和艾灸组：经过针灸治疗，大鼠呼吸急促、喘息、抓耳挠腮症状明显减轻，毛色光泽度较好，行动较前灵敏，饮食较前增加，二便趋于正常。

2.2 HE染色结果

空白组大鼠支气管管腔规整，黏膜无明显水肿，未见到淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润。模型组大鼠肺组织中可见支气管管壁及平滑肌增厚、管腔狭窄，可见大量的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。艾灸组大鼠支气管管腔基本规整，基底膜稍有增厚，可见少量炎性细胞的浸润。针刺组大鼠支气管管腔基本正常，基底膜稍有增厚，偶见嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润。具体见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果(×400)

2.3 血清IL-13含量表达

空白组大鼠血清中IL-13表达量很少;模型组大鼠IL-13表达较多，与空白组比较P<0.05，差异具有统计学意义;针刺组和艾灸组大鼠血清中IL-13表达量明显减少，与模型组相比P<0.05，差异均具有统计学意义;针刺组与艾灸组相比P>0.05，差异无统计学意义。结果见表1。

表1 各组大鼠血清中IL-13含量表达比较

2.4 肺组织STAT6 mRNA表达

空白组大鼠肺组织中STAT6 mRNA表达量很少;模型组大鼠STAT6 mRNA表达较多，与空白组比较P<0.05，差异具有统计学意义；针刺组和艾灸组大鼠肺组织STAT6 mRNA表达量明显减少，与模型组相比P<0.05，差异均具有统计学意义;针刺组与艾灸组相比P<0.05，差异具有统计学意义。结果见表2。

表2 各组大鼠肺组织STAT6 mRNA表达的比较

3 讨论

哮喘是由多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病，其中Th1与Th2的失衡是哮喘发病的重要环节[3]。Th2炎症因子的异常表达在哮喘发病中起重要作用，Th2可分泌多种白介素，如IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，促进肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞生长和分化，诱导哮喘发作[9]。

中医学认为，哮喘的病因包括六淫侵袭机体的外因和饮食、劳倦、七情内伤等的内因。病机包括痰饮内伏、外邪侵袭、气滞血瘀等邪实及肺、脾、肾三脏机能衰退等正虚两个方面。肺俞属足太阳膀胱经，内应肺脏，是肺脏精气输注于背部的腧穴，《素问·咳论》曰：“治脏者，治其俞”，具有调理肺气、止咳平喘，祛风邪、实腠理之功。邵经明教授通过对肺俞、大椎、风门三穴正交实验[10]，证实肺俞穴平喘效果最佳。大椎又名“诸阳之会”，为督脉穴，可通上达下，宣通一身之阳气，通调振奋督阳，有疏风解表、通阳散寒、宣肺降逆、理气平喘之功。风门属足太阳膀胱经，为外邪侵袭人体之门户，针之有疏散风寒、清泻邪热、调理肺气、止咳平喘、实腠固表之效。三穴同用，发作期能够降低气道阻力，有理肺降逆、止咳平喘之效；缓解期能够改善肺功能，益肺固卫，增强体质，预防发作，巩固远期疗效。

白介素-13(IL-13)是一个具有代表性的Th2型细胞因子,被认为是哮喘发病中最重要的细胞因子之一。具有介导Th2应答的功能，在支气管哮喘T细胞免疫反应及炎症反应中发挥着重要作用。IL-13能够不依赖于IgE和嗜酸粒细胞而单独诱导产生过敏性哮喘的病理生理改变，IL-13还可抑制Eos、B淋巴细胞的凋亡,从而使气道炎症的持续时间延长[11]。

信号转导和转录激活因子(signal transducer and activatorof transcription，STAT)6是Th2细胞的特异性转录因子，可促进Th2分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子[12]。通过JAK/STAT信号通路介导IL-4、IL-5、IL-13诱导的基因表达，促进IgE生成，导致哮喘发作[13]。STAT6的持续活化和过度表达会促进Th2的募集、增殖及Th2型细胞IL-4、IL-13的优势表达，从而导致Th1/Th2的失衡，而IL-13能诱导STAT6激活，从而趋化EOS等细胞向炎症部位聚集，引起气道炎症反应及气道高反应性[14]。

本实验研究观察血清中IL-13及肺组织中STAT6的表达变化影响，结果显示，模型组大鼠血清中IL-13及肺组织中STAT的表达明显高于空白组，提示IL-13及STAT6与哮喘的气道炎症的发生具有内在联系，针刺组及艾灸组大鼠血清中IL-13及肺组织中STAT6的表达明显降低，说明针刺、艾灸治疗均可以改善哮喘模型大鼠肺组织的炎症浸润状态以及肺间质结构的破坏。说明针灸“肺俞”“大椎”“风门”能明显降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺组织中STAT6的阳性表达，有效改善气道炎症，这可能是针灸改善哮喘症状，治疗哮喘的作用机制之一。