IL-1β辅助小胶质细胞M1型活化的作用机制研究

沈和平 官俏兵 杨毅 郭丽 盛泳佳 韩晨阳

研究发现，神经炎症在绝大多数中枢神经系统疾病（缺血性卒中、帕金森病、阿尔茨海默病、脑白质病变等）中扮演着重要的角色[1-2]。小胶质细胞作为脑组织中常驻的免疫细胞，在炎症发生过程中快速活化，通过其表型的变化发挥促炎和抗炎的作用[3-4]。正常生理情况下，小胶质细胞可以清除死亡的神经细胞，促进神经细胞的生长；但是小胶质细胞短期的过度活化将会引起神经炎症，从而损伤神经细胞。小胶质细胞活化后可分为M1型和M2型两种[5-6]。M1型为经典的活化型，它是由IFN-γ或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导产生的[7]，主要发挥促炎作用；而M2型正好相反，它是由IL-4和IL-13诱导产生的，主要发挥抗炎作用[8]。IL-1β是M1型小胶质细胞分泌的主要炎症因子[9]，但是其如何发挥促炎作用尚未阐明。IL-1β是一种具有多种生物活性的物质，不仅可作用于周围神经细胞，也可作用于免疫细胞，目前尚未发现IL-1β对于小胶质细胞有何作用。因此，本研究主要探讨IL-1β促进小胶质细胞M1型活化的作用和机制，为神经炎症发生、发展的机制探索提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 小鼠小胶质细胞BV2细胞系（武汉普诺赛生物技术有限公司，批号：CL-0493）；LPS（美国 Sigma 公司分装）；IL-6（批号：H007）、TNF-α（批号：H052）的ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（比色法检测，南京建成生物工程研究所，批号：A01301）；前列腺素G2（prostaglandin，PEG2）（美国 Abcam 公司，批号：133065）；CD86的免疫荧光抗体（美国Abcam公司，批号：209896）；免疫荧光染色试剂盒（美国Sangon Biotech公司，批号：670005）；M1型标志蛋白单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、趋化因子 8（chemokines-8，CXCL-8）的表达以及酪氨酸激酶（janus kinase 1，JAK1）、信号转导及转录激活蛋白 1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、磷酸化的JAK1（p-JAK1）、磷酸化的 STAT1（p-STAT1）的单克隆抗体（美国 CST 公司，批号：41987、10886、74129、9167、50996、14995）；JAK1抑制剂 IN-7（上海 MCE 公司，批号：126296）；重组人 IL-1β（美国 Sangon Biotech 公司，批号：600002）。

1.2 小胶质细胞的处理及分组 BV2细胞培养至对数期后，分为对照（Control）组、LPS 组、LPS+IL-1β 组。Control组常规培养；LPS组用终浓度为1 mg/L的LPS处理；LPS+IL-1β组先用15 μg/L的IL-1β预处理6 h，再用终浓度为1 mg/L的LPS处理。LPS的处理时间为24 h。IN-7处理实验中，将BV2细胞分为LPS组、LPS+IL-1β 组、LPS+IL-1β+IN-7组，其中 LPS+IL-1β+IN-7组在IL-1β处理前6 h用0.5 μmol/L IN-7预处理，阻断JAK1，其余处理同前。

1.3 培养基中IL-6、TNF-α、NO和 PEG2表达水平检测 培养基中IL-6、TNF-α和PEG2表达水平检测采用ELISA法，NO表达水平检测采用比色法。LPS干预BV2 细胞后，在 3、6、12、18、24 h 取培养基，用酶标仪在450 nm处测定吸光度（A），以标准品的浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线，根据A带入标准曲线拟合方程式，计算培养基中细胞因子水平，结果以ng/L表示。

1.4 BV2细胞中CD86荧光染色实验 采用细胞爬片法进行细胞的免疫荧光染色。将盖玻片置于6孔板中，接种BV2细胞后待细胞长至70%，LPS处理后，用新鲜配置的4%多聚甲醛固定细胞10 min。PBS洗3次后用0.2%的Triton X-100进行透化处理10 min，2% BSA封闭30 min，单克隆抗体1∶300稀释后进行室温孵育1 h，PBS洗3次后，加入IgG抗体进行标记孵育。最后用0.5 mg/L DAPI染色试剂进行细胞核染色，PBS洗2次后加封片，荧光显微镜下观察，以荧光强度表示。

1.5 MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信号蛋白JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1表达水平检测 采用Western blot法。收集细胞用PBS洗2次后加入预冷的1.0 ml RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，10 000 g转速下离心15 min，BCA试剂盒蛋白定量，用5×loading buffer煮沸8 min后进行电泳，PVDF膜使用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST稀释单克隆抗体一抗，孵育后PVDF膜用TBST洗2次后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育。孵育完成后用化学发光法检测，采用Image Pro-Plus 6.0软件进行光密度的分析，以GAPDH为内参，结果以目的蛋白与内参蛋白光密度值的比值表示。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。实验重复3次。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组培养基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表达水平比较 随着时间的延长，Control组培养基中 IL-6、TNF-α、NO和PEG2表达水平并无显著变化，且处于低水平。LPS组和LPS+IL-1β组培养基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表达水平随着时间的延长均上调（均P＜0.05）；与Control组比较，LPS组和LPS+IL-1β组培养基在 3、6、12、18、24 h 时 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表达水平均上调（均 P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+IL-1β 组培养基在 3、6、12、18、24 h 时 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表达水平均上调（均P＜0.05），见图1。

图1 各组培养基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表达水平比较[与Control组比较，*P＜0.05；与脂多糖（LPS）组比较，△P＜0.05]

2.2 各组细胞中CD86荧光强度比较 与Control组比较，LPS组和LPS+IL-1β组细胞中CD86荧光强度均上调（均P＜0.05）。与LPS组比较，LPS+IL-1β组细胞中CD86荧光强度上调（P＜0.05），见图 2（插页）。

图2 各组细胞中CD86荧光强度比较（LPS为脂多糖）

2.3 各组细胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信号蛋白表达水平比较 与Control组比较，LPS组和LPS+IL-1β 组细胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表达水平均上调（均P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+IL-1β 组细胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表达水平均上调（均P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、趋化因子8（CXCL-8）及酪氨酸激酶（JAK1）-信号转导及转录激活蛋白1（STAT1）表达水平比较[p-JAK1为磷酸化的JAK1；p-STAT1为磷酸化的STAT1；与Control组比较，*P＜0.05；与脂多糖（LPS）组比较，△P＜0.05]

2.4 抑制JAK1后，各组培养基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表达水平比较 IN-7预处理后，与LPS组和LPS+IL-1β 组比较，LPS+IL-1β+IN-7 组培养基在 3、6、12、18、24 h 时 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表达水平均下调（均 P＜0.05），见图 4。

图4 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各组培养基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表达水平比较[与脂多糖（LPS）组比较，*P＜0.05；与 LPS+IL-1β 组比较，△P＜0.05]

2.5 抑制JAK1后，各组细胞中CD86荧光强度比较IN-7预处理后，与LPS组和LPS+IL-1β组比较，LPS+IL-1β+IN-7组细胞中CD86荧光强度下调（均P＜0.05），见图 5（插页）。

图5 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各组细胞中CD86荧光强度比较（LPS为脂多糖）

2.6 抑制JAK1后，各组细胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信号蛋白表达水平比较 IN-7预处理后，与LPS组和LPS+IL-1β组比较，LPS+IL-1β+IN-7组细胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表达水平均下调（均P＜0.05），见图6。

图6 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各组细胞中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、趋化因子8（CXCL-8）及JAK1-信号转导及转录激活蛋白（STAT1）表达水平比较[p-JAK1为磷酸化的JAK1；p-STAT1为磷酸化的STAT1；与脂多糖（LPS）+IL-1β组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，△P＜0.05]

3 讨论

神经炎症是神经系统接收外界信号产生的先天性免疫应答反应，是机体防御系统启动的标志[10]。在神经炎症中，小胶质细胞释放过度的炎症因子，在疾病的发展过程中发挥着重要的作用[11]。小胶质细胞是中枢系统胶质细胞的一类，也是发挥神经炎症的主要细胞之一。既往研究已经发现小胶质细胞是一种巨噬细胞，可以分为M0、M1、M2型[12]。M0是小胶质细胞静止状态，而M1和M2是激活态的小胶质细胞。M1细胞主要发挥识别、趋化和吞噬的功能，然而小胶质细胞过度的激活可以大量释放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子，促进神经细胞的损伤。其机制和IL受体等信号激活有关，所以M1型巨噬细胞也是促炎细胞。其中IL-1β是巨噬细胞主要释放的促炎因子之一，有着多种病理生理功能[13]。而M2型细胞正好相反，主要起到抗炎的作用[14]，在神经炎症的发生、发展中M1/M2的平衡和转化是至关重要的。

既往研究发现TNF-α、IL-1β是最重要的炎症因子，它可以诱导星型胶质细胞和内皮细胞产生趋化因子和黏附因子，进一步增强慢性炎症的进展[15]。IL-1β对小胶质细胞具有自分泌的作用，能上调IL-6和TNF-α的表达，促进小胶质细胞的增生[15-16]，也可以诱导神经细胞的损伤和凋亡。因此，可以说IL-1β是通过小胶质细胞自分泌后影响神经细胞及周围细胞。但是在神经炎症中小胶质细胞的活化是级联放大的，所以分泌的IL-1β是否通过诱导小胶质细胞活化发挥作用也尚未可知。为了探明IL-1β对于小胶质细胞活化的作用，本实验采用LPS诱导小胶质细胞M1型活化，LPS是M1型激活的经典激活剂，可以诱导小胶质细胞向M1型激活，其中M1型标志物IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表达水平上调，而未经过LPS刺激的对照组细胞IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表达未见明显变化。值得注意的是，当用IL-1β 预处理 BV2细胞后，IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2等表达水平进一步上调，同时免疫荧光的结果也显示CD86的表达上调，明显高于单一LPS诱导。CD86是M1型细胞膜表面标志物，它的表达水平增高，说明了BV2向M1进行了转化。因此，从表型转化的角度来看，IL-1β可以辅助LPS促进小胶质细胞的M1型活化。

小胶质细胞的活化受到多条信号通路的调控，其中JAK1-STAT1是主要的调控信号。IFN-γ和LPS是诱导M1型活化的重要内源性物质，在JAK1信号中，STAT1的激活是M1活化的关键信号[17-19]。LPS和IFN-γ通过激活p-JAK1激活了p-STAT1，从而诱导信号的传递。而在本研究中也发现IL-1β可以进一步激活JAK1-STAT1的激活，表现为p-JAK1和p-STAT1的表达上调，且明显高于单一的LPS诱导。为了明确IL-1β是否通过该信号，本实验采用IN-7进行JAK1的阻断，结果显示，当JAK1阻断后，IL-1β的作用受到了抑制，M1型标志分泌因子IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表达水平下调，甚至低于单一LPS组，这是因为LPS通过促进JAK1信号激活发挥作用，当JAK1信号受到抑制后，LPS自然无法发挥作用。同时免疫荧光染色结果也显示CD86的表达水平下调。其标志物MCP-1和CXCL-8的表达下调[20]，JAK1信号中关键因子p-STAT1的表达下调。所以该实验证明IL-1β促进小胶质细胞M1活化是激活了JAK1-STAT1信号发挥作用的。

综上所述，本研究发现IL-1β可以辅助小胶质细胞的M1型活化，其作用机制是通过JAK1-STAT1信号发生的。这是神经炎症中IL-1β发挥作用的新机制，为神经炎症的研究提供了新的思路和参考。