p65和p16在局限期小细胞肺癌中的表达及其临床意义

黄鲁众 蒋中秀 赵志光

小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）约占肺癌的13%～15%，确诊时只有不足1/5属于局限期，大部分已错过手术时机[1-2]。SCLC患者虽然对放化疗较敏感，但总体生存期仍较短。近年来，随着靶向治疗和免疫治疗的出现，SCLC患者的生存期得到明显延长[3-4]。但SCLC的治疗水平并未取得突破性进展，对其发生、发展机制等尚不明确，有关其复发、预后评估的有效指标也较少。本研究应用免疫组化SP法检测128例局限期SCLC患者的癌组织和其中50例患者的癌旁肺组织中p65、p16的表达情况，并进行相关性分析和预后分析，以探讨p65和p16在局限期SCLC中的临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年1月至2018年12月在温州医科大学附属第二医院经病理确诊的128例局限期SCLC患者的癌组织标本，患者中男87例，女41例；年龄 33～74（56.60±11.08）岁，其中≤40岁 16例，＞40岁～≤60岁87例，＞60岁25例；肿瘤部位：左侧64例，右侧64例；肿瘤最大径：≤3 cm 27例，＞3.0 cm～≤7.0 cm 90例，＞7.0 cm 11例；淋巴结有转移72例，无转移56例；术前血清神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）水平升高77例，正常51例。并将其中50例患者的癌旁肺组织作为对照。纳入标准：（1）有明确的病理诊断；（2）局限期指病变局限于一侧胸腔且能被纳入一个放射治疗野，经胸部CT、腹部CT、脑MRI等确定；（3）患者行根治性手术，术前未行抗肿瘤治疗，术后予化放疗等辅助治疗；（4）临床资料完整。排除标准：（1）除外混合腺癌、鳞癌等其他恶性成分的患者；（2）排除随访时间不足6个月失访的患者。本研究经温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 SCLC癌组织与癌旁肺组织中p65、p16表达检测 采用免疫组化SP法。标本经固定、脱水、透明、包埋等制成石蜡切片，切片厚度为4 μm。脱蜡水化，滴加3% H2O2，室温孵育1 h，滴加柠檬酸液加热修复8 min后冷却至室温，滴加非免疫血清封闭3.5 h；滴加p65、p16抗体（分别按 1∶500、1∶200稀释）后 4 °C 冰箱过夜；滴加二抗室温孵育1 h，滴加辣根酶标记链卵白素液室温孵育1 h，滴加DAB试剂显色，放入苏木素复染，脱水透明封片。

1.3 免疫组化结果判定 p65阳性定位于细胞核，细胞质染色视为阴性；p16阳性定位于细胞核或细胞质。由2位病理科医生双盲阅片，随机选取5个包含癌组织的高倍视野，得出：（1）阳性细胞百分比：0%～10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分；（2）染色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。总分=阳性细胞百分比评分×染色强度评分，总分＜3分为阴性，总分≥3分为阳性。

1.4 临床资料收集 主要包括患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径、淋巴结转移和术前血清NSE水平等。采用住院（门诊）观察、电话联系等形式随访，随访截止时间为2020年12月。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计数资料组间比较采用x2检验；SCLC癌组织中p65与p16表达的相关性分析采用Pearson相关；预后分析应用Kaplan-Meier曲线，生存率比较应用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCLC癌组织与癌旁肺组织中p65、p16表达的比较 SCLC癌组织中p65阳性表达率为56.3%（72/128），明显高于癌旁肺组织的8.0%（4/50），差异有统计学意义（x2=34.212，P＜0.01）；SCLC癌组织中p16阳性表达率为35.2%（45/128），明显低于癌旁肺组织的70.0%（35/50），差异有统计学意义（x2=17.641，P＜0.01）。免疫组化结果见图1。

图1 小细胞肺癌（SCLC）癌组织与癌旁肺组织中p65、p16的表达（a：SCLC癌组织中p65表达呈阳性；b：癌旁肺组织中p65表达呈阴性；c：SCLC癌组织中p16表达呈阴性；d：癌旁肺组织中p16表达呈阳性；免疫组化SP法，×200）

2.2 SCLC癌组织中p65与p16表达的相关性 Pearson相关分析显示SCLC癌组织中p65与p16表达呈负相关（r=-0.406，P＜0.01），见表 1。

表1 SCLC癌组织中p65与p16表达的相关性（例）

2.3 SCLC癌组织中p65、p16阳性表达与临床特征的关系 SCLC癌组织中p65阳性表达与淋巴结转移和术前血清NSE水平均有关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤最大径均无关（均P＞0.05）。SCLC癌组织中p16阳性表达与淋巴结转移有关（P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径和术前血清NSE水平均无关（均P＞0.05），见表2。

表2 SCLC癌组织中p65、p16阳性表达与临床特征的关系（例）

2.4 SCLC癌组织中p65、p16阳性表达与预后的关系 128例SCLC患者中有9例失访，最终纳入119例患者进行预后分析。随访截止时，死亡107例，存活12例。患者总体中位生存期为20.3个月，1年和2年生存率分别为85.6%和37.6%，见图2a。p65阳性表达患者的总体中位生存期为18.9个月，明显短于p65阴性表达患者的 21.8个月，差异有统计学意义（x2=7.695，P=0.006），见图2b。p16阳性和阴性表达患者的总体中位生存期分别为21.3和19.8个月，两者比较差异无统计学意义（x2=3.228，P=0.072），见图 2c。

图2 小细胞肺癌（SCLC）癌组织中p65、p16阳性表达与预后的关系（a：SCLC患者总体生存期；b：p65的表达水平与SCLC患者预后的关系；c：p16的表达水平与SCLC患者预后的关系）

3 讨论

SCLC恶性程度高，较早发生淋巴结转移和远处转移，中位生存期短。近30多年来，其治疗水平基本处于平台期，初诊时的分期、规范的治疗是治疗的关键[5-6]。对于可行手术的局限期SCLC患者，术后化疗或同步化放疗可以控制肿瘤的生长，但其无进展生存期和总体生存期仍较短[1]。

本研究显示，SCLC患者p65表达上调，p16表达下调，可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥一定的作用。同时，SCLC癌组织中p65与p16表达呈负相关，提示两者相关的通路可能存在一定的关联。p65是NF-κB家族中含量最丰富、功能最重要的成员。其作用于肿瘤的机制主要包括：（1）激活细胞周期蛋白 D1（CycinD1），促进细胞无限生长[7-8]；（2）参与血管生成以及肿瘤微环境的形成，为肿瘤生长提供能量；（3）产生氧自由基造成DNA损伤[8]等。p16基因是最早发现的直接参与调控细胞周期的肿瘤抑制基因[9-10]，其表达产物p16INK4A与CDK4/6特异性结合，阻碍其与CycinD1形成复合物，以致细胞停留在G1期，无法进入S期[10-11]。当p16基因突变或失活时，细胞周期失去调控，导致细胞无限生长。

SCLC分期大多应用美国退伍军人医院研究小组制定的标准，TNM分期一般用于术前疾病评估[12]。局限期SCLC的术前TNM分期主要与肿瘤最大径和淋巴结转移有关。肿瘤最大径与肿瘤的增殖水平有关。随着医疗水平的进步以及患者对肺癌的认知水平和重视水平的提高，大多数患者会定期体检，所以就诊时，肿瘤体积不会过大。淋巴结转移与肿瘤的迁移水平有关。本研究得出在淋巴结转移的SCLC患者中，p65上调，p16下调。p65基因可直接作用于瘤细胞恶性表型相关基因，以及激活Snail转录因子，从而诱导上皮-间质转化，以获得更强的迁移能力[13]；而p16基因失活，可上调基质细胞衍生因子（SDF-1）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达[14]，同样可以促进上皮-间质转化。血清NSE是临床检测SCLC的首选肿瘤标志物，可用于疾病的进展与预后评估[15-16]。本研究中，p65的表达水平与术前血清NSE水平有关，提示p65基因的激活，可能促进神经内分泌细胞分泌NSE。

国内外关于p65与SCLC患者的预后研究不多，更多的预后研究是关于非小细胞肺癌。Lin等[17]研究显示，p65和p-p105共同阳性表达与非小细胞肺癌的预后不良有关，而p65的单独阳性表达与其无明显相关性。郭子君等[18]的一项关于SCLC的研究，得出p65阴性表达患者预后更好，与本研究结果一致。国内外关于p16与SCLC的研究主要是表达水平的变化，而有关预后生存的研究暂无报道。p16缺失突变包括纯合缺失和杂合缺失，在杂合缺失突变中是可以正常表达p16蛋白[14]，因此在蛋白水平研究p16基因突变与预后关系不如基因水平研究更严谨。

综上所述，p65、p16可能在SCLC患者的发生和发展中起一定作用；同时，p65也可能对SCLC患者的预后有一定的指导意义。