HCV单克隆抗体的制备及其应用的初步研究

江苏省医疗器械检验所 （江苏 南京 210012）

内容提要： 目的：丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染已成为全球公认的健康难题，目前并没有很好的疫苗和特效药，尽早检出HCV感染者是实现丙型肝炎早期诊断、阻断传播的重要途径。方法：研究通过免疫Core-NS4B融合重组蛋白，制备抗HCV单克隆抗体，并获得5H5和4E7-HRP最优的抗体配对组合，检测120例血清，同时与HCV-RNA检测做比较。结果：阴性血清均未测出阳性，HCV阳性标测出23例阳性，检出率77%，HCV-RNA测出26例，检出率87%；HCV可疑标本测出15例阳性，HCV-RNA测出17例；单项ALT增高的标本测出2例阳性，HCV-RNA测出1例。结论：研究所获得的抗体能够用于HCV抗原检测，具有巨大的潜力，为建立HCV抗原检测试剂盒奠定了基础，为临床检测提供了实验依据。

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）属黄病毒科，是一种主要经过血液传播的病毒，可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，感染后肝硬化发生率在20年内达30%，30年内达50%，对人类健康构成了极大危害。丙型肝炎（Hepatitis C，HC）呈世界性分布，全球约有近1.8亿HCV感染者，每年新增300万到400万人，每年超过35万人因丙型肝炎相关疾病死亡，HCV感染已成为全球公认的健康难题[1-4]。截至2015年，全球仅20%的慢性HCV感染者得到明确诊断，其中仅7.4%获得治疗[5]。中国属于HCV的中流行区和高流行区，感染率约为3.2%[6]。

2016年5月28日，第69届世界卫生大会上世界卫生组织（WHO）通过了《2016-2021年全球卫生部门病毒肝炎战略》[7]，即“至2030年消除病毒性肝炎的公共健康威胁”。2017年11月我国发布了《中国病毒性肝炎防治规划（2017-2020年）》，并于提出了“至2030年彻底消除丙型病毒性肝炎”的政府承诺[8]。“十二五”期间，丙肝高发地区的防治工作被列入国家重点攻关课题[9]。HCV核心抗原检出时间早于抗体，缩短了检测“窗口期”，可用于丙型肝较的早期诊断[10]。研究表明，HCV非结构蛋白4B（Nonstructural Protein 4B，NS4B）可能参与宿主细胞的多种信号转导通路，干扰转录调控、内质网应激、恶化等过程[11]。本研究利用HCV核心抗原（Core）和NS4B融合表达构建的Core-NS4B融合重组蛋白备抗HCV单克隆抗体，用所获得抗体进行配对并筛选，并对120份血液样本进行检测，同时与HCV-RNA检测方法做比较，为HCV临床检测提供了实验依据。

1.材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

雄性Balb/c小鼠（扬州大学实验动物中心），Core-NS4B融合重组蛋白（本室构建），HAT、HT、PEG 1500、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂（Sigma公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（北京碧云天生物技术有限公司），小鼠Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞（本室保存），DMEM培养基（GIBCO公司）、细胞培养板（NUNC公司），Protein A亲和层析柱（GE），丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒（广州达健生物科技），其他试剂均为分析纯。96孔聚苯乙烯酶标板（Corning）、酶联免疫检测仪（Thermo）。

1.2 单克隆抗体的制备

1.2.1 动物免疫

用Core-NS4B融合重组蛋白免疫5只6周龄雄性Balb/c健康小鼠。首次免疫用弗氏完全佐剂与Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化，在小鼠后颈背部多点注射，其中抗原用量为每只小鼠100μg。第2次免疫在2周后，弗氏不完全佐剂与与Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化，后颈背部多点注射。4周后做第3次免疫，再次颈背部多点注射。5周后，用间接ELISA法测小鼠血清抗Core-NS4B效价，在其中挑选1只免疫情况最好的小鼠，在准备融合的前3d加强免疫，方法：腹腔注射抗原液100μg。

1.2.2 间接ELISA方法的建立

以免疫小鼠血清作为阳性对照，SP2/0细胞上清作为阴性对照，Core-NS4B融合重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA筛选方法。Core-NS4B融合重组蛋白包被浓度为5μg/mL，每孔100μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加1% BSA 200μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加融合细胞上清100μL，每块酶标板各设一阴阳对照孔，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，加入TMB底物显色液，37°C作用15min，2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪测定OD值，波长为：450nm，判定依据：OD450≤0.3判断为阴性，OD450＞0.3，判断为阳性。

1.2.3 杂交瘤细胞株的建立

取小鼠骨髓瘤Sp2/0-Agl4细胞（对数生长期）与免疫脾细胞按1:5的比例用50% PEG进行融合，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0-Agl4细胞培养上清为阴性对照，用间接ELISA检测培养上清。选择强阳性克隆，用有限稀释法连续克隆化3～4次，直至有克隆孔的抗体100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高效价抗HCV单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养后，置液氮中保存。

1.2.4 腹水抗体的制备

采用小鼠体内繁殖法大量制备单克隆抗体。6～8周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡（0.5mL/只），2周后，将已扩大培养的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔（2×106个/只），10d后收集腹水，以间接ELISA法对腹水抗体效价进行测定，12000r/min，4°C离心30min，取上清备用。

1.3 抗体的纯化及测定

用Protein A亲和纯化小鼠腹水，用SDS-PAGE法对抗体纯度进行鉴定，并用凝胶成像系统进行分析，采用紫外吸收法对抗体浓度进行测定，将抗体均稀释到1mg/mL对其进行效价检测。

1.4 ELISA法单克隆抗体配对

1.4.1 单克隆抗体结合位点的分析

用ELISA相加实验测定OD450值，抗体之间产生相加效应的程度用指数AI=(2A1+2/A1+A2-1)表示，A1，A2表示不同单克隆抗体分别单独与抗原作用时的OD450值，A1+2表示两种单克隆抗体混合后于抗原作用时的OD450值，AI＞50%表示两种单抗针对不同的抗原表位。

1.4.2 单克隆抗体配对

采用夹心ELISA法，分别包被HCV单抗，包被浓度10μg/mL，Core-NS4B溶液稀释到5μg/mL加样，HRP标记抗体按照1:1000稀释加样，不同表位的抗体两两组合，TMB显色，测定OD450值。

1.5 血清标本检测

标本来源：南京市某医院体检血清标本120例，其中体检合格标本30例，HCV阳性标本30例，HCV可疑标本30例，单项ALT增高的标本30例。

双抗夹心检测：采用夹心ELISA法，包被HCV单抗，加血清标本，加HRP标记抗体，TMB显色，测定OD450值。

HCV—RNA检测：采用广州达健生物科技有限公司生产的丙肝病毒PCR检测试剂盒，按说明书上的方法操作。

2.结果

2.1 单克隆抗体的制备

细胞融合筛选，最终获得10株杂交瘤细胞，分别命名为1F8，2E6，2F1，3C5，3H3，3H11，4E7，5F10，5H5，6E5，注射到小鼠腹腔。每株获取8～12mL的优质腹水并取5mL进行纯化，获得抗体300～800μL。如表1所示，纯化后蛋白含量13.1～20.3mg/mL，凝胶成像分析纯度达到89%～92%，抗体效价为40万～640万。

2.2 单克隆抗体的配对

2.2.1 单克隆抗体结合位点的分析

在间接EHSA试验中，当Core-NS4B蛋白的包被浓度为5μg/mL时，10种抗体对应的效价为其饱和时的最大稀释度。保持Core-NS4B融合重组蛋白包被浓度为5μg/mL不变，将各株单抗两两以各自饱和时的最大稀释度加入同一个包被有Core-NS4B抗原的孔内作为一抗，间接ELISA反应后，测定450nm处的光吸收值，并计算相加指数AI。

表1. 10株抗体的浓度、纯度及效价

ELISA相加试验结果显示，2F1，3H3，4E7，5F10，5H5分别与其他9株单克隆抗体之间的相加指数AI大于50%，1F8，2E6，3C5，3H11，6E5五种单克隆抗体相互之间AI指数小于50%，说明2F1，3H3，4E7，5F10，5H5可能与Core-NS4B抗原结合的位点不同，1F8，2E6，3C5，3H11，6E5可能与Core-NS4B抗原结合位点相同。结合抗体效价等多方面原因，最终选择2F1，3H3，4E7，5F10，5H5，6E5进行下一步实验。

2.2.2 单克隆抗体配对

2F1，3H3，4E7，5F10，5H5，6E5六种单抗分别用作包被抗体及酶标抗体，交叉检测人Core-NS4B抗原。其中抗体包被量均为10μg/mL，酶标抗体按1:1000倍稀释使用。配对初筛中Core-NS4B融合重组抗原按5μg/mL使用。初步配对结果显示，单抗配对4E7-5H5在双抗体夹心法中有最好的检测效果（表2），因此选取5H5-4E7-HRP对进行配对检测血清样本。

表2. 单抗配对初筛结果

2.2.3 血清标本检测

用筛出的抗体对5H5-4E7-HRP检测120例血清标本，结果显示，体检合格的30例血清均未测出阳性。HCV阳性标本30例测出23例阳性，HCV可疑标本30例测出15例阳性，单项ALT增高的标本30例测出2例阳性（见表3）。用HCVRNA试剂盒检测上述样本，结果显示，HCV阳性血清标本测出26例阳性，HCV可疑血清标本测出17例阳性，单项ALT增高标本测出1例（见表3）。由此可见，5H5和4E7抗体配对能较好地测出HCV抗原，为临床检测HCV试剂盒的开发奠定了基础。

表3. 配对抗体5F9+1H11-HRP灵敏度检测

3.讨论

HCV是一种单股正链RNA病毒，其基因组由3个结构区和4个非结构区组成。HCV核心蛋白（Core）是结构区的基因编码的一种结构蛋白，结构相对稳定，抗原性强，具有蛋白的免疫优势区，在病毒装配与成熟过程中起关键作用，具有多种类型的生物活性，是与宿主细胞相互作用的重要环节，在HCV感染后的免疫逃逸中发挥重要作用[12,13]。NS4B是HCV的一个非结构蛋白，参与病毒复制和丙肝病理变化过程，NS4B相对于其他非结构蛋白在病毒进化上较为保守[14]。因此，制备Core和NS4B抗体对HCV检测具有重要的意义。

本研究通过免疫Core-NS4B融合重组蛋白，制备抗HCV单克隆抗体，获得5H5-4E7最优的抗体配对组合，并用筛出的抗体检测120例血清标本，同时与HCV-RNA检测做比较。结果显示，体检合格的30例血清均未测出阳性，HCV阳性标本30例，抗体对测出23例阳性，阳性检出率77%，HCVRNA测出26例，阳性检出率87%；HCV可疑标本30例，抗体对测出15例阳性，HCV-RNA测出17例；单项ALT增高的标本30例，抗体对测出2例阳性，HCV-RNA测出1例。充分说明本研究所建立的双抗夹心检测HCV抗原的体系能够初步应用于临床HCV抗原检测，具有巨大的潜力，为建立HCV抗原检测试剂盒奠定了基础，为临床检测提供了实验依据。