4 个紫花苜蓿品种对低温胁迫的生理响应及抗寒性评价

赵一航，孟令东，张晓萌，王丽娜，刘皓玥，毕琳琳，刘宏亮，殷秀杰

（1. 东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2. 雀巢奶牛养殖培训中心, 黑龙江 哈尔滨 150110；3. 雀巢谷物能力中心, 黑龙江 哈尔滨 150110）

紫花苜蓿 (Medicago sativa)是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有产量高、适应性强、再生能力强等特点[1]。‘肇东’、‘龙牧801’、‘东农1 号’和‘敖汉’4 个品种在我国北方被广泛种植[2-3]，而冬季低温是制约我国北方地区苜蓿生产的主要因素，部分地区出现苜蓿冻害减产等问题，遭受巨大经济损失[4]。低温会影响紫花苜蓿的正常生长发育，不仅会导致植物物质代谢失调，甚至会导致植株死亡[5]。因此，提高苜蓿品种抗寒性、选育抗寒苜蓿品种对我国北方地区发展苜蓿产业具有重要意义。

植物在低温胁迫下细胞膜被破坏，膜透性增加，相对电导率可以反映植物生物膜的透性，抗寒能力不同的植物电导率的变化会有显著差异[6]。杨国柱等[7]通过测量低温胁迫下12 个不同品系紫花苜蓿的相对电导率来比较其抗寒性。低温胁迫下植物体内活性氧不断积累最终导致膜脂过氧化产生丙二醛[8-10]，植物通过增加可溶性糖和游离脯氨酸[11-16]等渗透调节物质的含量，以及增强保护酶活性，如过氧化物酶和超氧化物歧化酶[17-19]，提高植物的抗寒能力。 因此可以通过测定低温胁迫下植物相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化物酶含量和超氧化物歧化酶的含量比较不同植物或者品种之间抗寒性的差异。叶片是植物代谢的主要器官，可以依据植物叶片的解剖结构特征和生长状况判断植物对其生长环境的适应性[20]。在低温胁迫下，植物内部的解剖结构会发生不同程度的变化。研究表明，细胞结构越紧密的苜蓿品种抗寒性越强[21]，抗寒性弱的苜蓿品种的叶片组织厚度大于抗寒性强的苜蓿品种[13]。

目前对不同品种苜蓿低温胁迫下生理响应和抗寒性的研究较多[21-25]，如通过对不同根型根系紫花苜蓿生理生化指标进行测定，从而对其进行抗寒性评价[23]；通过8 个品种紫花苜蓿的相对电导率和根茎活力计算半致死温度，从而对8 种苜蓿的抗寒性进行评价[24]。也有部分关于非生物胁迫下苜蓿叶片解剖结构的研究[21]。但是对不同品种苜蓿低温胁迫下的生理生化各指标进行系统性的分析，并结合其叶片解剖结构对抗寒性进行评价的相关研究较少[13]。因此，本研究通过对低温胁迫下4 种苜蓿生理生化指标和叶片解剖结构的观测，综合比较了4 种苜蓿的抗寒性，以期为我国北方地区筛选抗寒性强的紫花苜蓿品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源如表1 所列。

表 1 供试材料Table 1 Cultivars examined

1.2 试验设计

选取大小均匀一致的4 种苜蓿种子播种于穴盘中(穴盘规格为540 mm × 280 mm，50 穴)，每个穴内播种5～6 粒种子，将播种好的穴盘放置于培养箱中，每天按时浇水管理。培养条件如下：光暗周期为12 h/12 h，温度为白天(20 ± 1) ℃/夜晚(17 ± 1) ℃，空气相对湿度为65%。培养60 d 后，分别选取生长状况良好且均一的同种苜蓿植株进行低温胁迫处理，以20 ℃作为对照组 (CK)，以温度梯度4、0、-4 和-8 ℃进行低温胁迫，每个温度梯度的胁迫时间为24 h，对植株地上部分取样并用锡纸包好，作为待测试验样品，放入-80 ℃冰箱中保存，每个样品3 次重复[24]。

分别取4、0、-4 和-8 ℃处理组的苜蓿叶片和对照组的苜蓿叶片，切成5 mm × 5 mm 小块，立即放入酒精、醋酸、福尔马林混合固定液中固定24 h，采用常规石蜡切片法，经过取样、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（厚度8 μm）、粘片、去蜡、染色（苏木精染色）、中性树胶封片等步骤永久制片[25]。

1.3 测定指标与方法

先将所取样品进行液氮粗磨，再通过研磨机细磨后进行各指标测定。相对电导率采用电导法测定[26]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[27]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[27]，游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定[27]，超氧化物歧化酶活性采用氮蓝四唑法测定[27]，过氧化物酶活性采用愈创木酚比色法测定[28]。

1.4 解剖结构测定

用显微镜观察叶片横切面的形态结构和变化情况，测量并记录叶片厚度(μm)、栅栏组织厚度(μm)、海绵组织厚度(μm)、维管束直径(μm)等结构。

栅海比 = 栅栏组织厚度/海绵组织厚度[29]；

叶片组织结构紧密度 = (栅栏组织厚度/叶片厚度) × 100%；

叶片组织结构疏松度 = (海绵组织厚度/叶片厚度) × 100%。

1.5 统计方法

所有抗寒性生理指标和解剖结构数据应用SPSS 19.1 软件进行方差显著性分析，应用Excel 2013 对试验数据进行数据处理和图表制作。

1.6 隶属函数分析方法

用于分析的隶属函数值[ X1， X2]计算方程如下：

式中： X 为某种苜蓿某一指标的测定值； Xmax为4 种苜蓿此指标的最大值； Xmin为4 种苜蓿此指标的最小值。若所测指标与植物的抗寒性呈正相关关系，则采用式(1)计算隶属值，负相关用式(2)。累加4 种苜蓿各指标的具体隶属值，并求出平均值后进行比较，平均值越大则表明植物的抗寒性越强[30-31]。

2 结果与分析

2.1 相对电导率

在4 ℃处理下4 种苜蓿的相对电导率没有显著差异(P ＞ 0.05) (图1)。而-4 和-8 ℃处理下4 种苜蓿的相对电导率相比对照组均有大幅提升。与对照组相比，-4 ℃处理下4 种苜蓿的相对电导率上升幅度为‘敖汉’ ＞ ‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’；-8 ℃处理下4 种苜蓿的相对电导率上升幅度为‘敖汉’ ＞‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘肇东’。

2.2 丙二醛含量

除4 ℃处理下‘肇东’苜蓿的丙二醛含量低于对照外，其他处理下4 种紫花苜蓿的丙二醛含量均高于对照(图1)。随着温度的降低，‘东农1 号’和‘敖汉’的丙二醛含量呈先上升后下降的趋势，‘肇东’则呈上升趋势。与对照组相比，‘肇东’和‘龙牧801’苜蓿在-8 ℃处理下丙二醛含量最高，分别上升52.96%和59.90%。‘东农1 号’苜蓿在-4 ℃处理下丙二醛含量最高，与对照组相比上升幅度为66.12%；‘敖汉’在0 ℃处理下丙二醛含量最高，与对照组相比上升幅度为126.68%。4 种苜蓿受到低温胁迫后丙二醛含量总体表现为‘敖汉’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘龙牧801’ ＞‘肇东’。

2.3 可溶性糖含量

低温处理下4 种苜蓿的可溶性糖含量与对照组相比有所上升，-8 ℃处理下‘东农1 号’和‘敖汉’的可溶性糖含量与对照组相比略有下降(图1)。随着温度的降低，‘肇东’、‘龙牧801’和‘东农1 号’的可溶性糖含量呈先上升后下降的趋势，并且在0 ℃处理下最高。‘敖汉’在4 ℃处理下可溶性糖含量最高。与对照相比，‘肇东’和‘龙牧801’的可溶性糖含量总体上升最为明显，‘敖汉’无明显变化。

图 1 低温胁迫下紫花苜蓿的生理生化指标变化Figure 1 Physiological and biochemical indexes of alfalfa under low temperature treatments

2.4 游离脯氨酸含量

低温处理下4 种苜蓿的游离脯氨酸含量与对照组相比均有所提升，并且随着温度降低，4 种苜蓿的游离脯氨酸含量呈先上升后下降的趋势，4 种苜蓿的脯氨酸含量均在0 ℃处理下最高(图1)。与对照组相比，‘肇东’的游离脯氨酸含量上升最为明显，上升幅度达到179.3%；‘敖汉’的变化较小，上升幅度仅为23.7%。4 种苜蓿受到低温胁迫后游离脯氨酸含量总体上升幅度为‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’ ＞‘敖汉’。

2.5 过氧化物酶活性

在0、-4、-8 ℃处理下4 种苜蓿的过氧化物酶活性与对照组相比大幅提高，而4 ℃处理下4 种苜蓿的过氧化物酶活性与对照组相比变化不明显(图1)。4 种苜蓿在0 ℃处理下过氧化物酶活性最高，-4 和-8 ℃处理下的过氧化物酶活性比0 ℃处理下低。总体来看，低温处理下‘肇东’的过氧化物酶活性上升幅度最高，‘东农1 号’最低。

2.6 超氧化物歧化酶活性

低温处理下4 种苜蓿的超氧化物歧化酶活性与对照组相比有所上升(图1)。随着处理温度的降低，4 种苜蓿的超氧化物歧化酶活性均呈现先上升后下降的趋势，4 种苜蓿均在-4 ℃处理下酶活性最高，随后活性变弱，-8 ℃处理下酶活性下降明显，其中敖汉下降幅度最大，‘肇东’和‘龙牧801’的酶活性下降幅度较小。总体来看，低温处理下超氧化物歧化酶活性的上升幅度为‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘敖汉’ ＞‘东农1 号’。

2.7 隶属函数综合分析

仅凭单一指标难以对植物抗寒性进行评价，因此通过隶属函数综合分析4 种苜蓿的6 项生理生化指标，从而对抗寒性进行综合评价。结果显示(表2)，‘肇东’和‘龙牧801’的抗寒能力较强，‘敖汉’的抗寒能力最弱，4 种苜蓿的抗寒性为‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞‘东农1 号’ ＞ ‘敖汉’。

2.8 低温胁迫对苜蓿叶片解剖结构的影响

正常生长下4 种苜蓿的叶片厚度在96.14～129.9 μm，其中‘肇东’和‘龙牧801’差异不显著(P ＞ 0.05)(表3)。‘敖汉’与‘东农1 号’差异不显著，但显著大于‘肇东’和龙牧801 的叶片厚度 (P ＜ 0.05)。4 种苜蓿的叶片厚度为‘敖汉’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘龙牧801’ ＞‘肇东’。4 种苜蓿的栅栏组织厚度在47.04～53.99 μm，‘敖汉’的栅栏组织厚度最大，显著高于‘龙牧801’和‘东农1 号’，后两者差异不显著，‘肇东’显著低于其他3 种苜蓿(P ＜ 0.05)。4 种苜蓿的海绵组织厚度在37.41～65.70 μm，‘肇东’和‘龙牧801’的海绵组织厚度显著小于‘敖汉’。4 种苜蓿的维管束直径在62.36～78.59 μm，其中‘肇东’和‘东农1 号’差异不显著，‘龙牧801’与‘敖汉’差异不显著。4 种苜蓿的栅栏组织和海绵组织之比在1.04～1.31，其中‘肇东’和‘龙牧801’栅海比大于‘东农1 号’和‘敖汉’，并且‘肇东’和‘龙牧801’与‘东农1 号’和‘敖汉’之间差异显著(表4)。4种苜蓿的细胞结构紧密度在41.56%～52.79%，由大到小依次为‘龙牧801’ ＞ ‘肇东’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘敖汉’。

4 种苜蓿在不同温度处理下，叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度与对照组相比均有所减小(图2)。其中‘肇东’的叶片厚度与对照组相比减小幅度为27.50%；‘敖汉’的减小幅度为39.47%；‘龙牧801’的减小幅度为12.05%；‘东农1 号’的减小幅度为34.61%。变化幅度为‘敖汉’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’。

3 讨论

低温胁迫后植物细胞膜被破坏，膜透性增加，相对电导率可以反映植物生物膜的透性[32-33]。对照组中，4 种苜蓿的相对电导率存在显著差异，推测是由于不同品种的基因型不同而造成的。4 种苜蓿的相对电导率与对照组相比，‘肇东’的增幅最小，‘敖汉’的增幅最大。说明‘敖汉’在受到低温胁迫后其细胞膜的受损程度最严重。随着胁迫温度的下降，4 种苜蓿的相对电导率均呈现先平稳、再上升、最后平稳的趋势，4 种苜蓿的相对电导率均在-4 ℃时急剧上升，相对电导率呈“S”型变化趋势，这一结果与曾宪海等[34]应用电导率法及Logistic 方程评价引种海南儋州油棕(Elaeis guineensis)新品种抗寒性研究的结论相一致。研究表明，当植物受到低温胁迫时体内丙二醛含量均有不同程度的上升，可以反映植物细胞膜的过氧化程度[35]。本研究结果表明，低温胁迫下4 种苜蓿的丙二醛含量为‘敖汉’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘肇东’。这说明4 种苜蓿中，‘肇东’的抗氧化能力最强，‘敖汉’的抗氧化能力最弱，‘龙牧801’和‘东农1 号’的抗氧化能力介于两者之间。

表 2 不同苜蓿品种的隶属函数值Table 2 Subordinate function values of different alfalfa cultivars

表 3 低温胁迫下叶片解剖结构的比较Table 3 Comparison of leaf anatomical structure under low temperature treatments

表 4 苜蓿叶片解剖结构的参数测定结果Table 4 Determination of anatomical structure parameters of alfalfa leaves

图 2 4 种紫花苜蓿叶片的解剖结构Figure 2 Anatomical structure of leaves of four alfalfa cultivars

植物可以通过积累可溶性糖提高自身保水能力，低温胁迫下植物的可溶性糖含量越高，植物的抗寒能力就越强[36]。对照组中，‘东农1 号’和‘肇东’的可溶性糖含量较高；在低温胁迫下，‘肇东’和‘龙牧801’的可溶性糖含量上升且高于‘东农1 号’和‘敖汉’的可溶性糖含量，说明‘肇东’和‘龙牧801’在受到低温胁迫时，能够调节自身生理机能，使可溶性糖合成能力提高，从而更好地抵御低温。低温胁迫下4 种苜蓿的可溶性糖含量均呈先上升后下降的趋势，并且低温胁迫下抗寒性强的品种，其可溶性糖含量的上升幅度较大，这一结果与黑龙江省主要栽培葡萄(Vitis vinifera)品种抗寒性研究的结论[37]相一致。游离脯氨酸是植物体内一种重要的渗透调节物质，游离脯氨酸含量是衡量苜蓿抗寒性的一个重要指标[38]。随着胁迫温度降低，4 种苜蓿的游离脯氨酸含量在0 ℃处理下达到最高，随后含量降低。游离脯氨酸含量上升幅度为‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞‘东农1 号’ ＞ ‘敖汉’。4 种苜蓿中抗寒性强的品种低温胁迫下游离脯氨酸含量上升幅度大于抗寒性弱的品种，这一结果与张荣华等[39]关于脯氨酸含量对苜蓿抗寒性影响研究的结论相一致。

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)作为抗氧化防御系统可以清除氧自由基，对保护植物正常生理功能和提升植物抵御逆境的能力具有重要作用[40]。低温胁迫下，4 种苜蓿SOD 和POD 活性的变化规律较为一致，随温度降低SOD 和POD 活性均呈现先上升后下降的趋势，上升幅度为‘肇东’ ＞‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’ ＞ ‘敖汉’；SOD 和POD 活性上升达到最高后活性下降，这可能是因为处理温度低于苜蓿所能承受的最低温度，导致酶活性逐渐降低。低温胁迫下植物体内的SOD 和POD 含量均有所上升，并且抗寒性越强的植物酶活性越强，上升的幅度越大，但低温胁迫过于严重时，植物体内的酶活性降低。这与梁坤伦等[41]和钟海霞等[42]在垂穗披碱草(Elymus nutans)和葡萄的抗寒性研究中得出的结果一致，轻度低温胁迫会使植物体内SOD和POD 活性上升，但重度低温胁迫下，植物体内SOD和POD 活性会降低。

4 种苜蓿的细胞结构紧密度呈现显著差异，并且抗寒性强的品种细胞结构紧密度大于抗寒性弱的品种；但是细胞结构紧密度是否与其抗寒性有关仍需进一步研究。通过比较4 种苜蓿的维管束直径发现，‘肇东’和‘东农1 号’之间差异不显著，‘龙牧801’与‘敖汉’之间差异不显著；但是不同处理温度下4 种苜蓿与对照组相比，叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度与对照组相比均有所减小，并且呈显著差异。4 种苜蓿在不同处理温度下维管束直径均无明显变化，且与对照组相比差异不显著，这说明维管束直径不能作为比较抗寒性的指标。通过研究4 种苜蓿对照组的解剖结构发现，抗寒性弱的品种的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度均大于抗寒性强的品种。

4 结论

低温胁迫下，4 种苜蓿中‘敖汉’的相对电导率和丙二醛含量上升幅度最大，细胞膜损伤最为严重。低温胁迫下，4 种苜蓿的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性与对照相比有所上升，其中‘肇东’各个指标的上升幅度均最大，表明4 种苜蓿中‘肇东’对低温的抗逆性更强。4种苜蓿的抗寒性为‘肇东’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘东农1 号’ ＞‘敖汉’。对照组中4 种苜蓿的叶片厚度为‘敖汉’ ＞‘东农1 号’ ＞ ‘龙牧801’ ＞ ‘肇东’。抗寒性弱的苜蓿品种叶片厚度较大，抗寒性强的品种叶片厚度较小。抗寒性强的品种栅栏组织厚度、海绵组织厚度均小于抗寒性弱的品种，其细胞结构紧密度和栅海比均大于抗寒性较弱的品种。