注射用灯盏花素生物活性测定指标的研究

王 璐 刘 勤 张红宇 王 玮

云南省食品药品监督检验研究院,云南 昆明 650031

注射用灯盏花素是灯盏花素加入适宜的赋形剂，经冷冻干燥制成的无菌制品，其功能主治为活血化瘀、通络止痛，是《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》中药注射剂品种，临床广泛用于中风及其后遗症，冠心病、心绞痛等缺血性心脑血管疾病。注射用灯盏花素的现行质量标准收载于《中国药典》2015年版一部，其中将野黄芩苷的含量测定作为质量控制指标，但由于中药所含活性成分非常复杂，而且药效的发挥往往是多种活性成分共同作用的结果，因此中药检测任何一种活性成分均不能完全体现其整体疗效，为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性测定检测项目[1-2]，根据注射用灯盏花素的功能主治，选取小鼠体内血栓实验、小鼠常压耐缺氧实验、小鼠凝血时间实验来筛选适宜的生物活性测定指标。

1 试药与动物

1号样品：规格10 mg，批号20151126-2；2号样品：规格10 mg 批号20170302-2 ； 3号样品：规格25 mg 批号20151125-2；4号样品：规格25 mg 批号20160927-1；5号样品：规格50 mg，批号20161104-1；6号样品：规格50 mg，批号20161020-1；以上样品野黄芩苷含量测定分别为标示量的98.75%、98.60%、100.35%、99.62%、99.71%、100.17%。注射用灯盏花素最大人用剂量0.83 mg·kg-1。

胶原蛋白I型，酷尔生物，批号：B264565,规格1g；盐酸肾上腺素注射液，上海和丰制药有限公司，批号 10151101，规格1 mL∶1 mg；注射用盐酸川芎嗪，合肥平光制药有限公司，批号201509073，规格80 mg；尼莫地平注射液，扬子江药业集团有限公司，批号16051541，规格20 mL∶4 mg；血塞通注射液，规格5 mL∶250 mg 批号ZKC1501，昆明制药有限公司。

试验动物：小鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供，ICR,SPF级别，雌雄兼有，体重18～22 g，动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030。

2 实验方法及结果

2.1 小鼠体内血栓实验[3]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，体重18～20g，随机分为注射用灯盏花素组(6个批号共6组)，氯化钠注射液组(阴性对照组)、盐酸川芎嗪组(阳性对照组)共8组，每组12只。注射用灯盏花素组按25 mg·kg-1的剂量(临床人用剂量的30倍)给药，阳性药组给予60 mg·kg-1的盐酸川芎嗪(临床人用剂量的30倍)。各组均为尾静脉注射一次给药，给药体积0.2 mL/10g，给药30 min后，尾静脉注射血栓诱导剂造成小鼠血栓模型，血栓混合诱导剂含胶原蛋白0.60 mg· mL-1和肾上腺素0.02 mg· mL-1，给药体积0.1 mL/10g，观察小鼠死亡个数以及偏瘫未恢复数(15 min内)，偏瘫率=(死亡个数+15 min偏瘫未恢复个数)/总个数，保护率=(未偏瘫个数+15 min内偏瘫恢复个数)/总个数，阴性组偏瘫率大于等于80%说明造模成功。

阳性药组及4个批号的注射用灯盏花素与阴性组比较，小鼠死亡个数以及偏瘫未恢复数(15 min内)减少，差异有显著统计学意义。2个批号的注射用灯盏花素与阴性组比较小鼠死亡个数以及偏瘫未恢复数(15 min内)减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.2 小鼠凝血时间实验[4]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，体重18～20g，随机分为注射用灯盏花素组(6个批号共6组)，氯化钠注射液组(阴性对照组)、盐酸川芎嗪组(阳性对照组)共8组，每组12只。注射用灯盏花素组按25 mg·kg-1的剂量(临床人用剂量的30倍)给药，阳性药组给予200 mg·kg-1的血塞通注射液(临床人用剂量的30倍)，各组均为尾静脉注射一次给药，给药体积0.2 mL/10g，给药30 min后，用玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，深约4～5 mm，轻轻转动至有血液流出，于载玻片两端各滴一滴血，血滴直径约5 mm，立即用秒表计时，每隔10s用清洁牙签自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起，从计时起至挑起血丝止，所历时间即为凝血时间。

阳性药血塞通注射液组及5个批号注射用灯盏花素与阴性组比较凝血时间明显延长，差异有极显著统计学意义，1个批号注射用灯盏花素与与阴性组比较凝血时间延长，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 注射用灯盏花素对小鼠体内血栓的药效学研究

表2 注射用灯盏花素凝血时间的药效学研究

2.3 小鼠常压耐缺氧作用[4]取18～20g小鼠96只(雌雄兼有)，按体重随机分为阴性组、阳性药组以及6个批号的注射用灯盏花素组，共8组，每组12只。阴性组给予氯化钠注射液，阳性药组给予1.65 mg·kg-1的尼莫地平注射液(临床人用剂量的25倍)，注射用灯盏花素组按25 mg·kg-1的剂量(临床人用剂量的30倍)给药。各组均为尾静脉注射一次给药，给药体积0.2 mL/10g，给药30 min后，将小鼠放入盛有15 g钠石灰的广口瓶内(每瓶放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不漏气，开始计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。

阳性药组尼莫地平注射液及4个批号注射用灯盏花素与阴性组比较喘息时间明显延长，差异有极显著统计学意义。2个批号注射用灯盏花素与与阴性组比较喘息时间延长，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 注射用灯盏花素常压耐缺氧作用的药效学研究

3 讨论

3.1 中药质量标准中含量测定的局限性 生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用，其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法[5]。

中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难。目前中药质量标准中含量测定的建立与研究多半只是对中药产品成分的稳定性和可控性实行改进，并没有与中药的药效建立直接的内在联系[6]。尤其是用于临床的中药注射剂和危重病症治疗的中药制剂，更应该保证每批产品具有可靠的生物活性[7]。本研究表明，虽然6批注射用灯盏花素中野黄芩苷含量均符合目前质量标准规定，但生物活性测定结果有所不同，显示不同的生产工艺或同一企业不同的原料对中药注射剂的有效性存在明显影响。因此单纯控制某些指标成分的理化分析并不能全面反映中药注射剂产品的有效性，应该结合“生物活性测定”方法进行综合评价。

3.2 分析结果和比较方法 本试验研究根据《中国药典》2015年版四部附录“中药生物活性测定指导原则”[5]设计，根据药品的功能主治筛选生物活性测定方法。作为质量标准的生物活性测定方法，所选择的检测指标应当客观、专属性强，与功能主治相关，给药途径一般应与临床用药途径一致，还应当操作简便、成本低廉、检测指标明确、灵敏度高、重现性好[8]。

小鼠体内血栓实验，胶原蛋白和肾上腺素都是血小板聚集诱导剂，小鼠尾静脉注射后诱发体内肺栓塞，血栓形成，导致偏瘫和死亡。6个批号的注射用灯盏花素对血栓混合诱导剂诱导的急性血栓小鼠死亡个数以及偏瘫未恢复数(15min内)减少，说明其对注射血栓混合诱导剂形成体内血栓模型的小鼠有一定的保护作用，但程度各不相同。该实验中血栓诱导剂胶原蛋白和肾上腺素是微量注射，实际操作时对小鼠尾静脉注射给药要求较高，如果漏液实验结果易出现偏差。

小鼠常压耐缺氧实验，缺氧对机体是一种劣性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心脑等重要器官缺氧供能不足而死亡。野黄芩苷可提高机体的血氧利用率，降低机体耗氧量。同时可扩张血管(特别是冠脉和软脑膜血管)[9]，改善微循环，增加供氧量，从而改善机体缺氧状态，本实验以小鼠在常压缺氧条件下呼吸停止死亡为指标，研究注射用灯盏花素的耐缺氧作用。该实验受人为因素影响小且较敏感。

小鼠凝血时间实验，血瘀症常有“浓粘凝聚“的血液流变异常，血瘀证患者血液运行不畅，易致血栓形成，血管栓塞，灯盏花素能改善血瘀证患者的血液流变性[10]，能够抑制血小板功能，抑制血小板的粘附聚集和释放，改善淤血症高凝状态，6个批号的注射用灯盏花素均可不同程度延长小鼠凝血时间，该实验操作方法简单易行，不需要复杂仪器。

综上所述，筛选出适宜的注射用灯盏花素生物活性测定指标为小鼠常压耐缺氧实验和小鼠凝血时间实验。生物活性测定方法的建立作为一项新的内容还应进行方法学验证，包括精密度考察、方法适用性考察，如果经过验证，能基本达到综合控制与有效性相关的质量指标目的，则应将“生物活性测定”项目正式收载于质量标准中，并在今后的工作中不断完善提高。