金鸡毛草提取物经Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡愈合的作用研究*

于泽洋 李天博 王江宁

（首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038）

压疮即压力性溃疡，是由于压力或结合剪切力而导致的通常在骨突出处对皮肤和/或下面的组织的局部损伤［1］。压疮通常具有较大的损伤范围，容易引起败血症、全身衰竭和其他危及生命的并发症［2-3］。在昏迷、四肢瘫痪、衰老和虚弱、外伤性固定和严重营养不良等长期卧床患者中，压疮是一种常见的并发症［4］。Ⅲ期压疮构成严重感染和截肢的重大风险，因此寻求新的Ⅲ期压疮溃疡治疗方法意义重大。金鸡毛草具有舒筋接骨、凉血止血、消炎止痛、祛风消肿、降血糖的功效，常用于治疗咳嗽气喘、血瘀肿痛、目赤肿痛、崩漏外伤出血、支气管肺炎、小儿高热、百日咳、风湿关节痛、跌打损伤、骨折、乳腺炎、疮疡疔肿、烧烫伤、糖尿病等症［5］。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）途径是调节伤口愈合的主要过程之一，可改善伤口的血管生成和上皮重塑［6-7］。大量的实验研究表明Wnt/β-catenin信号通路参与了许多生物学过程等，包括细胞增殖、凋亡、分化以及干细胞多能性的维持［8］。本研究探讨金鸡毛草提取物经Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡愈合的作用，为Ⅲ期压疮溃疡的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠购自四川大学实验动物中心，6～8周龄，体质量200～250 g，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-0002，动物使用许可证号：SYXK（川）2018-0014，动物质量合格证号：SC2020031427，大鼠饲养环境温度为22～26℃，光照（12 h∶12 h光照-黑暗循环），湿度60%～70%。

1.2 试药与仪器

金鸡毛草提取物（原料药，纯度99%，甘肃益生祥生物技术有限公司，批号TR3067；用生理盐水配制成质量浓度0.4、0.8、1.6 g/mL的溶液备用）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所，批号C0105L、PI517、PI603、P5349-10）；TRIzol试剂、逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号MT0010、DT0034）；Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号DRR330）；放射免疫沉淀测定裂解缓冲液、BCA蛋白测定试剂盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Thermo Fisher公司，批号KK436532、DM30447、WE9153）；羊抗鼠 Wnt、β-catenin、GAPDH一抗（爱必信上海生物科技有限公司，批号TA502075、TA501107、TA0013）；羊抗鼠二抗（武汉晟亚生物技术有限公司，批号KPL-1255L）；SZX10-1111型显微镜（日本奥林巴斯公司）；MA-6000型实时荧光定量PCR仪（苏州雅睿生物技术有限公司）；ChemiDoc XRS凝胶成像分析系统（美国伯乐公司）。

1.3 模型制备

大鼠适应性喂养1周后进行实验，将大鼠右侧臀部备皮，于臀部切开长约2 cm皮肤，手术镊钝性分离臀大肌，然后将磁片（直径15 mm、厚2 mm）植入到臀大肌内，缝合皮肤，消毒。24 h后，将另一磁铁放置于植入磁片的皮肤处，两块磁铁互相吸引产生磁铁引力造成局部缺血，2 h后取下外源磁铁，间隔30 min重复以上步骤，每日4次。Ⅲ期压疮溃疡成模标准：4 d后，当受压皮肤变黑、变硬，用针刺不出血［9］。成功造模48只大鼠。

1.4 分组与给药

将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组与金鸡毛草提取物低、中、高剂量组，每组12只。另取12只正常大鼠作为对照组。金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠分别给予4、8、16 g/kg的金鸡毛草提取物灌胃［10］，灌胃体积 10 mL/kg，对照组和模型组灌胃生理盐水10 mL/kg，每天1次，给药2周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 创面愈合率的测定 分别于造模完成后和给药结束后对溃疡进行照相，并通过ImageJ软件（美国国立卫生研究院）测量溃疡面积，溃疡愈合率=（造模完成后溃疡面积-给药结束后溃疡面积）/造模完成后溃疡面积×100%。

1.5.2 血清炎症因子水平检测 给药周期结束后，对大鼠进行腹膜内麻醉，并从腹主动脉中提取全血样品，将样品在室温下放置1.5～2 h，然后以1 500×g离心20 min，分离血清，采用ELISA试剂盒检测血清IL-2、IL-4、TNF-α水平。

1.5.3 压疮溃疡组织病理观察 给药周期结束后，分离模型组、金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织和对照组大鼠相同部位正常组织，常规HE染色，显微镜观察大鼠压疮溃疡组织和正常组织病理改变情况。

1.5.4 压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平测定 收集模型组、金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织和对照组大鼠相同部位正常组织，使用TRIzol试剂提取组织中总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒在实时荧光定量PCR仪中进行反应。引物由上海麦特英杰生物科技有限公司设计和合成，引物序列如下：Wnt正向：5′-TGCTCATCACTTGCTAGTCGACTA-3′，Wnt反向：5′-TGTCGTAGCTAGTCGCGCTCCCGT-3′；β -catenin 正向：5′-TGTCGTAGCCTAGTGCTGTTGTGCGTA-3′，βcatenin反向：5′-GTGCGGGTCAACGTGTACGCTCTGTGT-3′；β-actin正向：5′-TTGTGACGTGACGCGAGATGTGCGT-3′，β-actin 反向：5′-CTGTGCGTGACGTACAGGTTGTGCG-3′。PCR反应体系如下：Premix Ex Taq TM 2 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、cDNA 3 μL、dH2O 4 μL。反应条件为：95℃ 15 s，61 ℃ 15s和72 ℃ 20 s，30 个循环。使用 2-ΔΔCt方法分析 Wnt、βcatenin mRNA表达水平。

1.5.5 压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平测定 收集模型组、金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织和对照组大鼠相同部位正常组织，用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液提取组织中总蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白质浓度，然后将蛋白裂解物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，将膜与稀释比均为1∶1 500的 Wnt、β-catenin、GAPDH 一抗常温孵育过夜，将膜用TBST缓冲液洗涤，然后与二抗（1∶5 000）孵育2 h，收集蛋白带图像，并用凝胶成像分析系统分析相对光密度。

1.6 统计学处理

应用SPSS23.0统计软件。实验结果以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠创面愈合率比较

见表1。与模型组比较，金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠创面愈合率升高（P＜0.05）；随着金鸡毛草提取物给药剂量的增加，金鸡毛草提取物各剂量组大鼠创面愈合率逐渐升高，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表1 各组大鼠创面愈合率比较（%，±s）

表1 各组大鼠创面愈合率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；金鸡毛草提取物低剂量组比较，△P＜0.05；与金鸡毛草提取物中剂量组比较，▲P＜0.05。下同。

组别对照组模型组金鸡毛草提取物低剂量组金鸡毛草提取物中剂量组金鸡毛草提取物高剂量组n 12 12 12 12 12创面愈合率-12.85±2.51 24.36±2.35#39.56±2.54#△50.59±2.34#△▲

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

见表2。与对照组比较，模型组大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平降低（P＜0.05）；随着金鸡毛草提取物给药剂量的增加，金鸡毛草提取物各剂量组大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平逐渐降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（mmol/L，±s）

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（mmol/L，±s）

组别对照组模型组金鸡毛草提取物低剂量组金鸡毛草提取物中剂量组金鸡毛草提取物高剂量组n 12 12 12 12 12 IL-2 156.63±23.65 496.65±26.58*374.31±24.85*#298.47±22.87*#△229.85±26.87*#△▲IL-4 136.96±19.65 485.63±18.47*362.42±19.54*#274.27±16.69*#△200.52±17.98*#△▲TNF-α 147.96±16.96 354.25±15.94*299.83±17.85*#257.71±14.66*#△205.56±16.54*#△▲

2.3 各组大鼠压疮溃疡组织形态学比较

对照组大鼠皮肤组织结构正常，可见大量成纤维细胞及毛细血管；模型组大鼠压疮溃疡组织大量炎症细胞浸润，成纤维细胞及毛细血管数目明显减少，表皮明显变薄；金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡创面组织已经出现结痂，且表皮明显增厚，炎性细胞浸润较轻。见图1。

图1 各组大鼠压疮溃疡组织形态学病理图（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平比较

见表3。与对照组比较，模型组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平降低（P＜0.05）；随着金鸡毛草提取物给药剂量的增加，金鸡毛草提取物各剂量组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平逐渐降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表3 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平比较（±s）

表3 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA水平比较（±s）

组别对照组模型组金鸡毛草提取物低剂量组金鸡毛草提取物中剂量组金鸡毛草提取物高剂量组n 12 12 12 12 12 Wnt mRNA 1.52±0.34 4.36±0.35*3.79±0.39*#3.02±0.37*#△2.45±0.35*#△▲β-catenin mRNA 1.17±0.15 4.08±0.14*3.41±0.18*#2.97±0.17*#△2.34±0.16*#△▲

2.5 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平比较

见表4，图2。与对照组比较，模型组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平降低（P＜0.05）；随着金鸡毛草提取物给药剂量的增加，金鸡毛草提取物各剂量组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平逐渐降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表4 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平比较（±s）

表4 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白水平比较（±s）

组别对照组模型组金鸡毛草提取物低剂量组金鸡毛草提取物中剂量组金鸡毛草提取物高剂量组n 12 12 12 12 12 Wnt蛋白0.18±0.03 1.12±0.13*0.81±0.10*#0.60±0.09*#△0.41±0.07*#△▲β-catenin蛋白0.20±0.04 1.08±0.14*0.87±0.12*#0.61±0.08*#△0.43±0.06*#△▲

图2 各组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin蛋白表达

3 讨 论

压疮动物模型可分为缺血性压疮，缺血性再灌注压疮和细菌感染的压疮模型。缺血性压疮模型表现出诸如血液浓缩等病理变化，其特征在于血液黏度和血栓形成增加，这可能导致局部血液循环障碍、水肿和组织坏死［11-12］。缺血再灌注压疮是在身体受压时引起的，并且毛细血管被阻塞，组织缺血缺氧将引起机体的补偿反应。由于钙超载，氧自由基的爆发以及炎症因子的增加，在恢复血流时进一步加重了组织和器官的损害。目前，普遍观察到压疮的原因是缺血再灌注引起的慢性皮肤和肌肉组织损伤。当前，通常使用磁压缩、内弹簧压缩和机械压缩方法来生成压疮模型。本研究采用磁性压缩法来制备大鼠皮肤和肌肉组织的缺血-再灌注压疮模型。建模后4 d，我们观察到皮肤变黑、变硬，且组织病理学鉴定证实了我们的观察为Ⅲ期压疮，表明本研究成功产生了大鼠Ⅲ期压疮模型。

金鸡毛草作为一种伤科中药，有其独特、卓著的疗效，为医家所习用。其含有多种活性成分，药理作用多面［13］。金鸡毛草不但可以单独应用，也可和其他中、西药配合应用，既能内服和外敷，又能灌肠和喷药，还可擦浴，具有止血愈伤、活血化瘀消炎消肿、排脓去毒的功效，对糖尿病足有肯定的疗效［14］。本研究结果显示：金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠创面愈合率高于模型组，血清IL-2、IL-4、TNF-α低于模型组，且呈剂量依赖性。这说明，金鸡毛草提取物能加速大鼠Ⅲ期压疮溃疡愈合，减轻大鼠Ⅲ期压疮炎症反应。病理学结果中，金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠Ⅲ期压疮溃疡创面组织已经出现结痂，且表皮明显增厚，炎性细胞浸润较轻，这也和上述结论相符。

本研究同时发现：金鸡毛草提取物低、中、高剂量组大鼠压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平低于模型组，且呈剂量依赖性。这说明，金鸡毛草提取物可促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡组织中Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平的表达进而激活Wnt/β-catenin信号通路。Ⅲ期压疮溃疡愈合有4个重叠的过程，包括止血、炎症反应、溃疡表面增加和溃疡表面重塑。治疗Ⅲ期压疮溃疡的主要挑战包括溃疡中缺少新血管，溃疡的持续感染，以及皮肤真皮细胞的新血管形成或分化差。研究证实Wnt/β-catenin信号转导的上调增加皮肤真皮细胞的活性。Wnt/β-catenin途径会影响Ⅲ期压疮溃疡愈合期间皮肤的厚度和色素沉着［15］。当皮肤处于Ⅲ期压疮溃疡时，Wnt/β-catenin途径的效应子参与了血管内皮细胞的表达。Wnt/β-catenin途径的下调是Ⅲ期压疮溃疡不可预测的原因之一，可能是由于Ⅲ期压疮溃疡产生的炎症应激反应导致R-脊椎蛋白（Rspo）3减少［15］。Rspo蛋白家族由4个成员（Rspo1-4）组成，与Wnt信号通路密切相关。已经证明Rspo蛋白可以激活Wnt信号传导途径，并且一些研究表明Rspo蛋白是诱导经典的Wnt信号传导途径的一类新的信号传导配体［16-18］。在糖尿病溃疡的愈合研究中也发现，当增加Wnt和β-catenin时，表皮细胞的增殖、分化和迁移会增强，溃疡愈合会加快。皮肤角质形成细胞中的Wnt信号通路会影响创伤后皮肤的厚度和色素沉着，高水平的Wnt可以防止因高葡萄糖水平引起的血管内皮细胞损伤。β-catenin的异常调节可以促进或抑制凋亡，而Wnt/β-catenin信号的上调可以增加高葡萄糖抑制的系膜细胞的活性［19-20］。这些研究结果与本研究结果一致。

综上所述，金鸡毛草提取物能加速大鼠Ⅲ期压疮溃疡愈合，减轻大鼠Ⅲ期压疮炎症反应；其机制可能与金鸡毛草提取物可促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡组织Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表达进而激活Wnt/βcatenin信号通路有关。