青黛通过影响GPR41/43信号通路调控溃疡性结肠炎大鼠Treg/Th17免疫平衡的机制研究*

孙中美 李军祥 路琼琼 丁庞华 史 瑞 赵兴杰 谭 祥 姜 慧 毛堂友

（北京中医药大学东方医院，北京 100078）

溃疡性结肠炎是一种发生于结、直肠黏膜的反复发作的非特异炎症性疾病，主要表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重等，严重影响患者的生活质量［1］。前期研究发现，青黛可通过调节肠道菌群及短链脂肪酸丁酸水平，从而明显改善DSS诱导的结肠炎，但是下游具体调控机制尚未阐明［2］。最新研究表明，G蛋白偶联受体（GPRs）可作为丁酸的特异性受体，介导肠上皮细胞的屏障功能，维持机体的免疫稳态［3］。本实验在前期研究的基础上，从GPRs信号入手，重点研究其下游Th17/Treg细胞相关因子的表达，以进一步探究青黛治疗溃疡性结肠炎的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的SPF级雄性SD大鼠（180～220 g）购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK-2016-0002，饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心，温度20～24℃；相对湿度50%～60%，12 h光照/黑暗循环，所有大鼠自由进食饮水。

1.2 药物 青黛配方颗粒购自北京康仁堂药业有限公司，药物的制备及质量检测均由北京康仁堂药业有限公司完成。每日灌胃前，将青黛充分溶解于烧开的去离子水中，获得青黛溶液；根据前期研究，本实验青黛剂量折合生药量为 600 mg/kg［2］。

1.3 试剂与仪器 葡聚糖硫酸钠（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潜血试纸（珠海贝索生物技术有限公司，广东珠海），GPR41抗体（OmnimAbs，OM184469），GPR43抗体（OmnimAbs，OM173356），FOXP3抗体（OmnimAbs，OM279147），RORγ抗体（OmnimAbs，OM188985）；反转录试剂盒：HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪，CW2582）；qPCR试剂盒：KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×）（KAPA Biosystems，KK4601）。

1.4 分组及干预 本实验是前期研究的延伸，大鼠分组、造模以及各组干预方法均如前报道［2］。24只健康的SPF级雄性SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白组、模型组、青黛组。模型组、青黛组大鼠自由饮用4.5% DSS水溶液以制备结肠炎模型，空白组大鼠自由饮用去离子水作为对照；同时青黛组大鼠予青黛（600 mg/kg）灌胃处理，空白组、模型组予去离子水灌胃处理。干预7 d后麻醉处死大鼠，取血及结肠组织。

1.5 Western Blotting法检测结肠 GPR41、GPR43、RORγt、FOXP3蛋白表达 称取大鼠结肠组织，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，充分匀浆后，4℃13 000 r/min离心20 min，提取上清液。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度；随后电泳，转膜，封闭；兔抗大鼠GPR41（1∶500）、GPR43（1∶500）、FOXP3（1∶500）、RORγ（1∶500）抗体，小鼠抗大鼠 β-Actin（1∶1 000）抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min；加入山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG（1∶1 000），室温孵育 40min。TBST洗膜，ECL显影，Gel Image system ver.4.00分析蛋白条带灰度，计算目标蛋白含量。

1.6 RT-qPCR检测结肠孤核受体（RORγt）mRNA、叉头蛋白P3（FOXP3）mRNA的表达 Trizol法提取结肠组织总RNA，应用逆转录试剂盒反转录成cDNA后，加入相应引物按照试剂盒说明进行PCR扩增，计算各组2-ΔΔCt值，求得目的基因相对于GAPDH基因的mRNA表达量。RORγt、FOXP3、GAPDH的引物序列及长度如表1。

表1 PCR引物序列

1.7 ELISA法检测血清IL-10、IL-17含量 大鼠腹主动脉取血后，4℃4 000 r/min离心10 min分离血清，应用大鼠IL-10、IL-17酶联免疫试剂盒，按照说明书检测大鼠血清中IL-10、IL-17的浓度。

1.8 统计学处理 应用GraphPad Prism 8.01对实验数据进行统计处理，以（）表示，数据符合正态分布且通过方差齐性检验，进行单因素方差分析，不符合正态分布或方差不齐者则进行非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠结肠GPR41、GPR43蛋白表达比较 见图1，表2。与空白组比较，模型组GPR41、GPR43蛋白的表达均显著降低（P＜0.05），经过青黛治疗后，GPR41、GPR43蛋白的表达较模型组明显增加（P＜0.05）。

图1 各组大鼠结肠GPR41、GPR43蛋白的表达

表2 各组大鼠结肠GPR41、GPR43蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠结肠GPR41、GPR43蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别空白组模型组青黛组n 8 8 8 GPR41 0.4609±0.0465 0.2183±0.0335△0.4405±0.0644*GPR43 0.4736±0.0170 0.2100±0.0962△0.4555±0.0176*

2.2 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3 mRNA表达比较 见表3。与空白组相比，DSS诱导的结肠炎模型大鼠结肠RORγt的基因表达增加，而FOXP3的基因表达下降；经青黛干预后，RORγt mRNA的表达较模型组明显降低（P＜0.05），FOXP3 mRNA的表达则明显升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3 mRNA表达比较（±s）

表3 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3 mRNA表达比较（±s）

组别空白组模型组青黛组n 8 8 8 RORγt mRNA 1.046±0.3632 1.456±0.2193 0.860±0.2070*FOXP3 mRNA 1.0400±0.3358 0.5140±0.2368 1.1700±0.4511*

2.3 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3蛋白表达的比较 见图2，表4。与空白组比较，模型组大鼠结肠RORγt蛋白的表达显著提高（P＜0.01），FOXP3蛋白表达显著降低（P＜0.01）；青黛干预后，大鼠结肠RORγt蛋白的表达较模型组大鼠明显降低（P＜0.05），FOXP3蛋白的表达显著提高（P＜0.01）。

图2 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3蛋白的表达

表4 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠结肠RORγt、FOXP3蛋白表达比较（±s）

组别空白组模型组青黛组n 8 8 8 RORγt 0.1906±0.1224 0.5453±0.0363△△0.3481±0.0147*FOXP3 0.6099±0.0662 0.2386±0.0657△△0.4827±0.0351**

2.4 各组大鼠血清IL-10、IL-17水平比较 见表5。与空白组相比，模型组大鼠血清IL-10含量明显降低（P＜0.05），而血清IL-17含量明显升高（P＜0.05），经青黛干预后，大鼠血清IL-10含量较模型组大鼠明显升高（P＜0.05），血清IL-17含量明显降低（P＜0.05）。

表5 各组大鼠血清IL-10、IL-17水平比较（pg/mL，±s）

表5 各组大鼠血清IL-10、IL-17水平比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组青黛组n 8 8 8 IL-10 43.60±9.015 30.28±4.962△43.37±2.244*IL-17 1.524±0.2742 2.034±0.1576△1.564±0.2319*

3 讨论

溃疡性结肠炎病变呈连续性分布，主要累及结肠、直肠的黏膜和黏膜下层；以腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重为主要症状并常伴有皮肤、关节等肠外表现［4-5］。溃疡性结肠炎发病机制复杂，包括环境因素、生活方式、遗传因素、肠道菌群紊乱、免疫反应失调等［6］。目前针对本病，西医的主要治疗方法包括水杨酸制剂、糖皮质激素制剂、免疫抑制剂、生物制剂等，但存在不良反应明显、价格昂贵等问题。前期临床研究证明中医药治疗溃疡性结肠炎症状改善明显，安全性好［7］。

青黛具有清热解毒、凉血消斑的功效［8］，临床广泛应用于皮肤黏膜疾病、溃疡性结肠炎等的治疗［9］。靛蓝和靛玉红为青黛的主要活性成分［10］。本项目组前期研究中利用高效液相法对青黛配方颗粒中靛蓝、靛玉红的含量进行测定，分别为300.7、1.45 μg/mg，并且发现青黛能够通过改善肠道菌群失调、提高短链脂肪酸，尤其是丁酸的含量，从而缓解DSS诱导的结肠炎［2］。本实验在前期研究的基础上，重点研究GPR41/43及下游Th17/Treg细胞相关因子的表达，探究中药青黛治疗溃疡性结肠炎的具体作用机制。

GPR41、GPR43属于G蛋白偶联受体家族成员，广泛表达于脂肪组织、肠道、肝脏、脾脏等，是短链脂肪酸的主要受体。炎症反应发生时，GPRs可以调节炎性因子产生，抑制炎性T细胞的增殖，起到缓解炎症的作用［11-12］。此外，有研究证明，GPR43在被短链脂肪酸激活后，能够诱导Treg细胞的分化［13］，有效预防肠道炎症，且在修复肠黏膜损伤中也发挥了重要的作用［14］。目前认为Th17/Treg轴的平衡失调与溃疡性结肠炎的发生发展关系密切，是治疗溃疡性结肠炎的重要靶点之一［15］。临床研究证明，IBD患者外周血中Treg细胞显著降低，Th17细胞显著升高，两者比例严重失衡［16］。Th17是一类CD4+T细胞，IL-6与TGF-β共同诱导RORγt的表达，诱导Th17细胞的分化［17］；Th17细胞由于具有分泌IL-17的能力而被命名，可以产生包括但不限于IL-17，IL-22和IL-23等细胞因子，具有募集中性粒细胞，并在感染部位促进炎症的作用，在众多炎症性疾病中扮演者重要的角色。Treg细胞产生抗炎细胞因子IL-10等，抑制各种免疫细胞的活性，从而抑制过度的免疫反应。Th17与Treg在炎症和免疫反应中起到了相反的作用［18］，维持两者之间的动态平衡至关重要。

本研究发现，与空白组相比，DSS诱导的结肠炎大鼠肠道短链脂肪酸受体GPR41、GPR43表达明显降低，其下游Th17细胞转录因子RORγt的表达及细胞因子IL-17水平明显升高，而Treg细胞的转录因子FOXP3的表达及细胞因子IL-10水平明显降低；青黛的干预明显逆转了上述改变，与模型组大鼠相比，青黛组大鼠结肠GPR41、GPR43蛋白表达明显升高，RORγt、IL-17表达明显降低，FOXP3、IL-10表达量明显升高，结合前期研究结果，表明青黛通过影响GPR41/43信号通路调节下游Th17/Treg平衡治疗溃疡性结肠炎的机制。本项研究完善了青黛通过调节“菌群-代谢-免疫”信号轴治疗溃疡性结肠炎的作用机制，为青黛的临床应用提供了进一步的科学依据。