硫化氢通过抑制氧化应激减轻糖尿病心肌病病变

矫立杰，魏亚新，李鸿珠

(哈尔滨医科大学 基础医学院 病理生理学教研室， 黑龙江 哈尔滨 150086)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)具有多种特征，包括高血糖、胰岛素抵抗、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加、线粒体功能障碍和内皮功能异常。DCM的发展不同于动脉粥样硬化、瓣膜病、高血压和其他常见的心血管疾病致病因素，它本身是一种可能发生心力衰竭的独立机制。对于其他气体信号分子，如一氧化氮已经很好地发挥了治疗作用，但对硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)的生理作用知之甚少。它也有可能作为一种治疗性气体分子发挥作用。研究表明H2S的供体硫氢化钠可以增加心肌细胞的存活率、减少ROS的生成[1]。同时给予外源性H2S治疗可以改善DCM病变，推测提高H2S的生理水平可能是治疗DCM的一种潜在的新的治疗选择。

鉴于H2S具有减轻DCM的作用，并且外源性提供的H2S具有十分不稳定性，增加内源性H2S的产生以发挥抑制DCM的作用尤为重要。本课题组主要研究调控内源性H2S产生的方法及H2S抑制DCM的机制。其中，H2S 通过抑制氧化应激减轻DCM的发生是研究的重点。本文根据查阅文献并结合本研究论述了DCM与氧化应激的关系及H2S通过抑制氧化应激减轻DCM的机制。

1 DCM与氧化应激作用

慢性高血糖是DCM发生的主要原因，高血糖环境可以诱导细胞产生过量ROS，导致氧化应激，影响线粒体的新陈代谢。适量的ROS可以促进细胞和组织的再生，但是过量的ROS对心血管系统有极大害处，会导致细胞的氧化损伤。ROS引起的氧化应激是导致DCM病变的重要危险因素[4]。在DCM、阿霉素诱导的心肌病的患者和动物模型中观察到ROS产生增加和抗氧化能力降低[2,3]。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂质过氧化的副产物，是氧化应激损伤的重要检测指标之一[4]。另外，糖尿病心脏模型相对于正常心脏模型可以表达更多的MDA。并且，糖尿病心肌细胞MDA的表达水平和ROS含量均显著高于正常心肌细胞[5]。同时，糖尿病小鼠心脏组织中Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1(Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor 1，RasGRF1)表达相对于正常小鼠是上调的。RasGRF1可以介导氧化应激作用进一步加重DCM病变程度[6]。当减少RasGRF1时可以减弱氧化应激作用并改善糖尿病小鼠的心脏功能，同时改善心脏结构重构[6]。并且慢性糖尿病发生时可以使心脏组织中的氧化应激相关蛋白p67phox和NOX4水平明显升高。另外抑制氧化应激相关标志物NOX1、NOX4和线粒体动力相关蛋白的表达均可改善DCM心肌细胞的损伤。这些结果都表明了氧化应激作用与DCM的发生发展有着密切的联系。寻找通过抑制氧化应激减轻DCM发生的药物尤为重要。据报道，H2S 可通过下调氧化应激减轻DCM的发生。

2 H2S的产生及代谢

H2S主要是由哺乳动物组织中依赖于磷酸吡哆醛的酶内源性产生的，血浆和组织中H2S的正常水平为50～160 μmol/L。产生H2S的酶主要是胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate thiotrans-ferase，3-MST)以及半胱氨酸氨基转移酶(cysteine aminotransferase，CAT)[7]。在大多数细胞和组织中，CBS和CSE是合成H2S的主要内源酶。 CBS分布在全身，是肝、肾和脑等组织中内源性H2S产生的关键酶。CSE主要存在于心血管系统。与CBS和CSE不同的是，3-MST主要存在于肾、肝和心肌细胞的线粒体中。在非酶作用下，H2S也可以通过某种方式从一部分细胞内的硫磺中释放出来。例如，在红细胞和某些组织中已发现在生理条件下含硫氨基酸和维生素B6可以产生H2S。然而，这种方式生产的H2S的确切生物学作用尚未确定。

在生理条件下，H2S主要有以下几种代谢途径。在大多数情况下，H2S形成的硫氢根(HS)在线粒体中快速氧化形成硫代硫酸盐，然后进一步转化为亚硫酸盐，最后转化为硫酸盐随尿液排出[7]。H2S也可以通过硫醇-S-甲基转移酶甲基化形成二甲基硫醚和甲硫醇[8]。此外，与其他两个气体信号分子(一氧化碳和一氧化氮)相似，H2S与血红蛋白具有高亲和力，与血红蛋白相互作用是H2S的分解代谢途径之一。H2S具有多种生理功能，例如，舒张血管、降低血压、抗凋亡、抗炎性反应和抗氧化应激。在这些功能中，H2S在抗氧化应激中的作用已成为多年来研究的主要焦点。

3 H2S抑制氧化应激减轻DCM的可能机制

3.1 H2S通过抗氧化应激蛋白酶途径发挥作用

H2S可以增强抗氧化应激蛋白酶如GPX(glutathione peroxidase)、SOD(superoxide dismutase)和CAT(catalase)的活性发挥抗氧化应激功能并可作为ROS的直接清除剂。在糖尿病心脏病模型中，H2S可以提高GSH/GSSG(glutathione)比值，增强SOD1、SOD2、CAT和GPX的活性及蛋白质表达水平而发挥抗氧化作用[9]。GPX是H2S介导的抗氧化剂衍生物中最常见的，它通过氧化还原反应起作用。人体摄入硒代蛋氨酸后，90%的硒在人体中通过硒的转硫途径转化为硒化物，然后可用于硒蛋白的合成[8]。而GPX中的GPX1至GPX4和GPX6可以与H2O2自由基反应从而中和H2O2[10]。SOD的催化活性包括酶活性中心Cu和Mn的还原氧化，具有非常重要的抗氧化作用。SOD首先将过氧化物修饰成H2O2，随后CAT或GPX将H2O2转化为水，最终使ROS的毒性完全消失。并且SOD1和SOD2都能降低H2O2诱导的氧化损伤的发生。在SOD1突变小鼠中，caspase-1和caspase-3的凋亡信号依次被激活：caspase-1在细胞死亡的早期阶段激活，caspase-3在细胞死亡的最后阶段激活[11]。CAT可以与SOD相互合作催化过氧化物生成水和氧气，使得过氧化物不会与ROS在铁螯合物作用下反应生成非常有害物质。在CAT抑制剂叠氮化钠存在的情况下，过氧化物的含量显著上升[12]。另外，H2S可以提高SOD的含量来清除H2O2和超氧化物来减轻异丙肾上腺素诱导的心肌缺血损伤后心脏的脂质过氧化[13]。

3.2 H2S 通过非酶抗氧化应激物质途径发挥作用

H2S还可以通过非酶抗氧化应激物质如GSH等发挥其相关功能。GSH作为一种抗氧化剂，在细胞抵御氧化应激中发挥着重要作用[10]。H2S可通过增加细胞内GSH的含量来保护神经元免受氧化应激，并提高细胞的活力。在缺血/再灌注引起的氧化应激时，GSH水平降低，而H2S可以恢复缺血/再灌注所降低的GSH水平从而减轻氧化应激作用对心肌细胞的损伤。在DCM中H2S也可以发挥相似的作用以减轻DCM病变程度。

3.3 H2S 还可以通过调控某些信号通路发挥抑制氧化应激的作用

核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)是核碱性亮氨酸拉链转录因子(nuclear factor erythroid 2，NF-E2)家族的成员之一[14]，对包括ROS和活性氮在内的过氧化物高度敏感。在细胞质内,Nrf2可以与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelehSample related protein-1，Keap1)半胱氨酸残基偶联，当氧化应激出现之后Keap1可以与Nrf2解偶联同时释放出Nrf2，随之Nrf2移位到细胞核中，而H2S可以促进这一过程[15]。进入到细胞核中的Nrf2可以进一步激活下游靶蛋白的表达，调控抗氧化蛋白酶/非酶的活性，从而发挥抗氧化应激作用[16]。并且，H2S处理30 min后，Nrf2在心肌组织的细胞核中聚集，并保持在一个增加的水平至少2 h。此外，H2S处理24 h 后可升高Nrf2下游的HO-1和Trx1蛋白质的表达[17]。而HO-1可以通过抑制游离血红素发挥重要的抗氧化作用。并且Nrf2可以介导SOD和GPX蛋白质的表达发挥其抗氧化应激作用。γ-GCS作为GSH合成的一种限速酶，当激活Nrf2信号通路时γ-GCS的含量明显增加，进一步导致GSH的含量明显增加[18]。这说明Nrf2信号通路发挥作用主要通过调控HO-1、SOD、GPX和GSH等物质的表达。由此可见，H2S可通过调控Nrf2-Keap1通路发挥抗氧化应激作用。

沉默信息调节因子2相关酶类3(silent mating type information regulation 2 homolog-3, SIRT3)，是一种依赖NAD的脱乙酰酶，主要存在于线粒体中，调节线粒体能量代谢和新陈代谢及防止氧化应激的蛋白质表达[19]。H2S可以降低NAD/NADH(nicotinamide adenine denucleotide)的比值，并且可以增加SIRT3的S-硫酸化和P62上的转录活性，并诱导了其靶蛋白OPA1、ATP合成酶β和SOD2的脱乙酰化，导致线粒体活性氧的生成减少，减轻氧化应激对于心肌细胞的损伤[20]。H2S对Sirt3敲除小鼠细胞无保护作用。除此之外，当SIRT3上的Cys256、Cys259、Cys280和Cys283残基突变时，H2S诱导SIRT3的S-硫酸化作用也会随之失效。这表明H2S 通过调控SIRT3发挥抗氧化作用减轻DCM的发生(图1)。

图1 H2S 通过抑制氧化应激减轻糖尿病心肌病的机制Fig 1 Mechanism of H2S alleviating diabetic cardiomyo-pathy by inhibiting oxidative stress

NOX(nitrogen oxidase)1-5、双氧化酶1、双氧化酶2合称为NOX蛋白家族，这一蛋白家族在全身各个细胞和组织中几乎都有表达。NOX在机体中发挥着重要的作用，当它接受细胞信号刺激之后会迅速激活产生超氧阴离子，随后进一步生成ROS等。当抑制NOX通路以后，p67phox、p22phox和NOX4的水平明显降低，ROS生成减少，细胞抗氧化能力明显增加[21]。H2S可以抑制这一蛋白家族的活性，进而减少ROS的生成，减轻氧化应激作用对细胞的损伤。然而对于H2S是否可以通过这一途径减轻DCM发生时的氧化应激作用尚不清楚，希望后续试验可以加以验证。

4 问题与展望

目前治疗DCM的策略包括运用胰岛素及胰岛素分泌药物、口服降血糖药物、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和钙离子通道拮抗剂等。然而，上述合成药物有许多副作用，包括胃肠紊乱、肝毒性、腹痛和泌尿生殖道感染等[22]。补充H2S可减轻高血糖引起的氧化应激对心肌细胞的损伤[23]，并副作用较小。这提示，H2S可能成为治疗DCM的一种新的治疗手段。但是对于心血管系统如何稳定的提供H2S以发挥其治疗作用的报道却少之又少。同时，H2S治疗DCM的分子机制仍不十分清楚。因此未来还需进一步探究H2S作用于DCM的分子机制及如何稳定提供H2S已达到治疗DCM的目的。