CFSE标记神经祖细胞方法的建立与验证

周佳锋，马孟杰，彭小忠,2*，舒鹏程*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室 医学灵长类研究中心 神经科学中心，北京 100005；2.中国医学科学院 医学生物学研究所，云南 昆明 650118)

大脑皮质作为神经系统的最高级部分，在意识、运动调节等多方面发挥重要功能，而神经祖细胞(neural progenitor cells, NPCs)在大脑皮质的发育中起到至关重要的作用。发育早期神经祖细胞不对称分裂产生神经元，而在晚期部分细胞能继续产生胶质细胞[1]。因此研究神经祖细胞能够加深人们对大脑皮质的了解。

特异的标记以及分选神经祖细胞是研究祖细胞必不可少的实验。目前常用的标记方法包括5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)标记、病毒标记以及子宫内电转(in utero electroporation)标记[2-6]。羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)可透膜，在胞内被水解为乙酸基团，水解后的CFSE无法透膜，结合胞内蛋白从而稳定标记细胞[7]。将CFSE注射到侧脑室，所有与脑脊液直接接触的细胞都将被标记，包括处于M期的神经祖细胞[8]。Denis Jabaudon等人开发的FlashTag技术就用到了上述的原理[7]。然而若要做到上述的特异标记神经祖细胞，必然要求染料能够较好地局限在脑室区，而非向上扩散到皮质板区。本研究探索了CFSE标记神经祖细胞的方法并进行了体内、体外验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：本研究用到的所有小鼠均为SPF级CD-1孕鼠，购自北京大学医学部，12周龄，怀孕天数为14.5 d，体质量在50 g左右。完成实验后的小鼠通过颈椎脱臼法处死。本研究已通过北京协和医学院基础学院实验动物中心的实验动物伦理审查(伦理编号ACUC-A01-2021-009)。

1.1.2 主要试剂：CFSE(Thermo Fisher Scientific公司)，D-PBS(Gibco公司)。使用抗体如下：兔抗FITC(ab19224, 1∶500稀释)、兔抗Tbr2(ab23345, 1∶500稀释)、兔抗NeuroD2(ab104430, 1∶500稀释)(Abcam公司)；兔抗Sox2(Sigma-Aldrich AB5603, 1∶500稀释)、兔抗Cux1(sc13024, 1∶500释)、鼠抗Tle4(sc365406, 1∶500稀释)(Santa Cruz公司); 抗兔647荧光二抗(A-31573, 1∶1 000稀释)、抗鼠647荧光二抗(A-31571, 1∶1 000稀释)(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宫内注射:参考以往的鼠胚电转实验以及“FlashTag”方法[7,9]，将孕鼠麻醉后，小心分离出胎鼠，利用玻璃毛细管针，在E13.5和E14.5分别将混有快绿(Fast Green)的CFSE注射到侧脑室，注射量为0.2 μL，随后将胚胎放回腹腔，缝合。

1.2.2 免疫荧光实验:收集的组织固定包埋于-80 ℃。组织冰冻切片厚度为16 μm。绵羊血清封闭后孵育一抗，4 ℃过夜。二抗用对应源的荧光二抗，稀释比例为1∶1 000。

将流式分选得到的细胞铺板，待细胞固定到爬片上后再进行免疫荧光步骤，操作与上述类似。

1.2.3 神经祖细胞分选:CFSE注射到侧脑室后1 h，颈椎脱臼法处死孕鼠，收集胎鼠，用镊子分离大脑皮质两侧半球的背侧，随后使用剪刀破碎组织，用accutase 酶于37 ℃消化30 min左右，期间每5 min用1 mL移液器吹打20次[10]，获得的细胞悬液过筛成单细胞悬液，离心后用300 μL 0.5% BSA D-PBS(Dulbecco’s phosphate buffer saline)重悬。细胞悬液在上机前用200 μL移液器重悬，采用Sony SH800全自动流式分选仪，分选出荧光强度前10%的细胞[7]，记为强阳性细胞。

2 结果

2.1 CFSE能够快速标记VZ区细胞

在CFSE被注射到侧脑室后1、3和6 h时收取胚胎，检测信号(图1A)。可以看到CFSE信号均匀的分布在室周区ventricular zone (VZ)区域，包括背侧和腹侧，同时还延伸至第三脑室(图1B)。注射后1 h，可以在VZ区观察到较强的CFSE信号，同时，所有有丝分裂标志物(PH3)阳性的细胞均被CFSE标记(图1C)。注射后3 h，CFSE依然能够标记VZ区细胞，但是有少量PH3阳性细胞并未被标记(图1C′，白色箭头)。注射后6 h，CFSE信号在最低端区域已无法检测到，同时被标记的细胞也已向上迁移离开该区域(图1C″)。

A.A graphic diagram of the injection of CFSE and the detection strategy; B.an overall view of the distribution of CFSE at 1 hour post-injection; C-C″.co-labelling with mitotic marker PH3 at 1, 3 and 6 hours post-injection, respectively; scale bar=100 μm图1 CFSE的分布高度局限于VZ区Fig 1 CFSE showed a highly restricted distribution within the VZ(n=3)

2.2 CFSE长时程标记具有一定的稳定性

在胚胎期第14.5天(embryonic day 14.5, E14.5)进行CFSE标记，出生后第1天(postnatal day1, P1)收取组织检测(图2A, A′,D,D′)，通过免疫荧光对大脑皮质神经元进行标记，显示CFSE信号集中在Tle4的上方，即皮质上层区域(图2C)。CFSE的信号强度存在较大的差异，部分细胞的信号非常微弱，用FITC抗体可以放大信号(图2B,B′，白色箭头)。到P3时，CFSE信号集中在上层，在Cux1阳性区域形成一个较薄的亚层(图2F)。类似地，通过FITC抗体增强信号，可以发现有较多的细胞CFSE信号发生了衰减(图2E,E′,白色箭头)。

A-A′, D-D′.an overall view of the distribution of CFSE signal; B-B′, E-E′.detection with anti-FITC to enhance the signal; C, F.co-labelling with Tle4 and Cux1, respectively; scale bar=500 μm for A-A′ and D-D′;scale bar=200 μm for the rest图2 CFSE信号在长时程标记中有衰减Fig 2 CFSE signal decayed in long-term labelling(n=3)

2.3 CFSE可用于分选神经祖细胞

CFSE注射1 h后收取脑组织，分离背侧皮质，FACS分选荧光强度前10%的细胞(图3A)，记为强阳性细胞。分选后的细胞通过Sox2、NeuroD2和Tbr2免疫荧光检测以确定其身份(图3B-B″, C-C″, D-D″)。统计发现Sox2阳性细胞占所有强阳性细胞的70%，Tbr2阳性细胞占13%，而NeuroD2阳性细胞占37%。

A.FACS sorting of top 10% positive cells; B-B″, C′-C″ and D-D″.co-labelling with Sox2, NeuroD2 and Tbr2 to identify sorted cells; E.a bar chart of the ratio of marker-positive cells to total FT-positive cells;S for Sox2, T for Tbr2, N for NeuroD2 and F for CFSE图3 CFSE可用于分选神经祖细胞Fig 3 CFSE was suitable for sorting of neural progenitor cells (scale bar=100 μm, n=3)

3 讨论

神经干细胞的在体标记和示踪是揭示神经系统发育机制的重要手段，目前常用的标记方法有BrdU标记、电转标记以及FlashTag等[2,7]。原理上，BrdU是一种核苷酸类似物，在S期DNA复制时掺入进而标记细胞。子宫内电转通过电场作用将表达荧光蛋白的质粒转入细胞内，主要标记S期和M期的细胞。FlashTag则是利用了某些脂溶性染料进入细胞后被分解为水溶性物质进而被锁定在细胞内的特点，将染料注射到脑室后标记VZ区M期细胞。

上述标记原理决定了它们的检测时间和标记时长上存在差异。BrdU可以快速掺入正在复制的DNA中。因此，在注射后30 min即可被检测到。CFSE在注射后也可以快速进入细胞进行标记，据报道在注射后的20 min即可检测到信号。而电转的质粒表达蛋白需要10 h甚至更久[7]。在标记时长方面，三者也存在差异，通常认为BrdU的标记时长在2～6 h，6 h后体内的BrdU浓度已无法再标记细胞。以往的文献报道CFSE的标记时长在2～3 h[7]，而本研究的结果与以往的报道有一定的差异。在本研究中，CFSE注射后3 h，VZ区依然有较多的CFSE残留，能够继续标记细胞，而到注射后6 h，VZ区已几乎没有CFSE信号，因此推测CFSE的标记时长在3～6 h。与上述两种方法相比，电转质粒是依赖电场的瞬间标记，电场作用消失后也就无法再标记细胞。

CFSE标记神经祖细胞后可进一步被用于细胞分选。本实验分选了CFSE荧光强度前10%的细胞。虽然这些强阳性细胞大部分是Sox2阳性的神经祖细胞，但部分却是NeuroD2阳性的细胞，而NeuroD2仅表达于有丝分裂后的神经元(post-mitotic neurons)[11]。CFSE主要标记VZ区底端的细胞，但CFSE也有可能向上渗透标记远端的细胞，同时部分远端细胞的end-feet可能会吸收CFSE进而也被标记上[7]。另外，细胞被分选后还需在培养基中进行长达10 h的细胞爬片，期间部分细胞可能发生分化，表达NeuroD2。综上，虽然目前的分选策略已可以保证一定的纯度，但或许设置更严格的分选策略能进一步提高分选的纯度。