高效液相色谱法检测肝达康颗粒中5种成分

刘振丽，徐丽

(驻马店市食品药品检验所 食品药品检验，河南 驻马店 463000)

肝达康颗粒是由北柴胡、白芍、当归、茜草、白术、茯苓、鳖甲、湘曲、党参、白茅根、枳实、青皮、砂仁、地龙、甘草12味中药制成的中成药[1]。肝达康颗粒具有疏肝健脾、化瘀通络的作用，适用于慢性乙型肝炎具肝郁脾虚兼血瘀证候者[2-3]。白芍的主要有效成分为芍药苷，茜草发挥作用的物质基础为大叶茜草素、羟基茜草素，枳实、青皮的主要有效成分为挥发油类物质柚皮苷、橙皮苷[4-5]。本研究使用高效液相层析(high performance liquid chromatography，HPLC)检测肝达康颗粒中芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5种成分的质量分数，对肝达康颗粒药品质量进行评价。

1 研究方法

1.1 试剂、仪器、药品

1.1.1试剂 试剂及厂家信息见表1。

表1 试剂及厂家信息

1.1.2药品 肝达康颗粒(厂家：贵州健兴药业有限公司，国药准字Z19980083，规格：每袋8 g)；对照品均购买于中检所(中国食品药品检定研究院)。芍药苷对照品(批号110736-201842，质量分数97.4%)；大叶茜草素对照品(批号110884-201405，质量分数99.0%)；羟基茜草素对照品(批号111898-201603，质量分数98.5%)；柚皮苷对照品(批号110722-201312，质量分数94.7%)；橙皮苷对照品(批号110721-201316，质量分数96.2%)。

1.1.3仪器 由真空脱气机、四元泵、自动进样装置、柱温箱和光电二极管矩阵检测器组成的1260型HPLC仪(美国Agilent公司产品)，sartorius MSA225S电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司产品)，SBL-22DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司产品)。

1.2 色谱条件Diamonsil(钻石一代)C18分析色谱柱(5 μm ，250×4.6 mm)，流动相：乙腈-0.05%磷酸水(体积分数)。流速：1.0 mL·min-1。梯度洗脱：0～25 min，7%乙腈；25～30 min，7%～12%乙腈；30～55 min，12%～20%乙腈；55～75 min，20%～34%乙腈；75～80 min，34%～85%乙腈；80～85 min，85%乙腈；85～95 min，85%～87%乙腈；95～100 min，7%乙腈(体积分数)。UV检测波长：250 nm。柱温：35 ℃。

1.3 供试品及对照品溶液制备(1)供试品溶液的制备：取适量肝达康颗粒，置于研钵中，研成细粉，电子天平精密称取2.0 g，置于150 mL锥形瓶中，精密量取甲醇适量，加入锥形瓶中，超声30 min，进行提取。超声结束后，甲醇补足到150 mL，过滤，获得滤液。(2)5种对照品溶液的制备：取适量5种对照品，甲醇溶解制成芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷质量浓度分别为0.421 4、0.322 7、0.309 0、0.217 4、0.433 3 g·L-1的对照品混合储液，甲醇稀释5倍，得5种对照品质量浓度分别为0.084 28、0.054 54、0.061 80、0.043 48、0.086 66 g·L-1对照品溶液。(3)阴性对照品溶液制备：制备不含白芍、茜草、枳实和青皮的阴性对照药品，按上述方法制备。

1.4 线性关系考察分别精密量取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL对照品溶液，置于10 mL容量瓶中进行稀释，定容至刻度线。按照1.2中的色谱条件上机检测，进样量为10 μL。以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴，进行线性回归分析。

1.5 精密度实验准确量取10 μL对照品溶液，按照1.2中的色谱条件上机检测，连续重复6次。记录 5种物质的峰面积，通过计算获得相对标准偏差值(RSD)。

1.6 稳定性实验取1.3中制备的供试品溶液，分别于配置完成后0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL检测，记录各个峰面积，外标法计算5种化合物在各个时间点的质量分数，并与配置完成时比较，获得精确度值(RE)。

1.7 重复性实验取适量的同一批号肝达康颗粒，按照1.3中供试品的制备方法进行溶液制备，按照1.2中的方法10 μL进样检测，通过外标法计算获得化合物质量分数，并最终得到相对应的RSD。

1.8 回收率实验取适量的同一批肝达康颗粒，置于研钵中研成细粉，取6份约0.25 g的细粉，精密称定，分别置于6个150 mL容量瓶中，精密量取对照品储液4 mL，按照1.3中的方法制备供试品溶液。10 μL上样检测，计算5种化合物的回收率。

1.9 样品测定精密称取适量肝达康颗粒，按照1.3中的方法制备供试品溶液，按照1.2中的方法上样检测，外标法计算肝达康颗粒中5种化合物的质量分数。平行进行3次重复试验，求平均值。

2 结果

2.1 线性关系5种化合物在对应的线性范围内，R均大于0.999 0，表明线性关系较好。见表2。

2.2 精密度实验结果芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷的峰面积的RSD分别为0.58%、0.62%、0.44%、0.39%、0.67%，表明仪器的精密度较好。

2.3 稳定性实验结果供试品溶液中5种化合物在各个时间点的RE见表3所示，表明5种化合物在 12 h内的稳定性良好。见表3。

表3 5种化合物的稳定性

2.4 重复性实验结果芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5种化合物质量浓度的RSD分别为0.21%、0.28%、0.33%、0.30%、0.49%，实验重复性较好。

2.5 回收率实验结果5种化合物回收率的平均值分别为98.87%(RSD=0.43%)、98.79%(RSD=0.52%)、99.91%(RSD=0.39%)、98.82%(RSD=0.32%)、98.04%(RSD=0.72%)。

2.6 样品测定结果肝达康颗粒种芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷的平均质量分数分别为1.484 72(RSD=0.65%)、1.022 40(RSD=0.27%)、0.558 74(RSD=0.34%)、0.436 32(RSD=0.64%)、1.974 01(RSD=0.44%)mg·g-1。

3 讨论

芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5种化合物的UV最大吸收波长各不相同[6-7]。对照品溶液经过光电二极管矩阵检测器全波长扫描后，5种化合物在250 nm处吸收峰面积、峰高均较好，因此，最终选择UV检测波长为250 nm。研究表明，茜草中茜草素、大叶茜草素、羟基茜草素等有效成分设置柱温为35 ℃[8]。毕秋佐等[9]使用HPLC法分离鉴定肝达康颗粒中白芍苷、橙皮苷、柚皮苷等成分柱温设置为30℃。在正式实验前，对柱温进行摸索，设置25、30、35、40 ℃ 4个温度，在综合考虑分离度及保留时间下，选择35 ℃。目前，HPLC流动相的选择主要集中在乙腈-水、乙腈-0.2%的磷酸水以及甲醇-水[10-11]。预实验时，分别使用乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%的磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水和甲醇-水进行梯度洗脱，发现乙腈-0.05%磷酸水目标化合物与肝达康颗粒中其他物质分离度高，峰型好，无拖尾现象，最终以乙腈-0.05%磷酸水为流动相进行梯度洗脱。曾分别使用50%甲醇、75%甲醇、甲醇对肝达康颗粒进行提取，比较提取效率，结果发现甲醇作为提取剂杂质峰较少，因此，选择甲醇作为提取剂。对白芍中有效成分的提取主要方法主要有水提法及甲醇超声提取法[12]。

本研究通过HPLC法对肝达康颗粒中芍药苷、大叶茜草素、羟基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5种化合物进行检测，考察了该方法的精密性、稳定性、可重复性，结果显示HPLC检测肝达康颗粒中的有效成分具有精密度高、稳定性好、准确性较高、简单易操作等优势，可用于肝达康颗粒的质量控制。