烟草转录因子 NtMYB42基因的克隆与分析

张程涵， 赵会纳， 余 婧， 余世洲， 许本波， 雷 波*

(1.长江大学 生命科学学院， 湖北 荆州 434025； 2.贵州省烟草科学研究院 烟草行业分子遗传重点实验室， 贵州 贵阳 550081)

0 引言

【研究意义】烟草(NicotianatabacumL.)是以收获叶片为目标的经济作物，是西南地区主要特种经济作物之一。烟叶木质素含量是影响其品质的重要因素之一，木质素含量高的烟叶具有强烈刺激性、涩口，木质气重，导致其吸食品质差[1-3]。因此，探明烟草中木质素合成的调控网络，解析调控网络中的关键调控因子，对利用基因工程改造烟草木质素含量，改良烟叶品质具有重要意义。【前人研究进展】木质素是植物细胞壁的重要组分之一，具有重要的生物学功能，如利于营养物质及水分在植物体内长距离运输、增强植物细胞和组织的机械强度以及对各种胁迫的防御能力等[4]。在高等植物中，木质素生物合成途径研究较多，木质素来源于芳香族氨基酸苯丙氨酸，经公共苯丙烷代谢途径的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL) 3个关键酶催化后形成4-香豆酰辅酶A，进入木质素分支途径后，进一步被转化为肉桂醇衍生物，脱氢还原形成木质素单体后合成木质素。木质素的生物合成还与苯丙烷代谢途径的其他分支相互作用[5-6]。在木质素合成代谢途径中，转录因子发挥着重要的作用，近10年研究证明，木质素的生物合成受转录因子NAC-MYB网络的调控[7-8]。其中，MYB转录因子在木质素生物合成中的调控作用解析也成为热点。MYB转录因子是植物特有的一类转录因子，其在N端有一段51～52个氨基酸组成MYB结构域，根据所含的MYB结构域数目不同，主要分为R1-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB 3个亚类[9]。木质素代谢合成中的MYB转录因子，主要是R2R3型，通过与木质素生物合成途径关键酶基因启动子区AC元件结合进行调控[10]。模式植物拟南芥的AtMYB58和AtMYB63是首次报道的木质素特异性转录激活因子[11]，其MYB能够直接激活PAL、C4H和4CL等木质素生物合成基因，从而调控木质素的生物合成。AtMYB4作为阻遏物直接靶向木质素生物合成基因4CL等[12-13]，过表达AtMYB4的转基因植株中，木质素含量降低。拟南芥AtMYB20、AtMYB42、AtMYB43和AtMYB85激活AtMYB4，激活苯丙氨酸和木质素生物合成，优化苯丙氨酸向木质素生物合成途径的流动[14]。玉米ZmMYB31和ZmMYB42通过调节木质素的生物合成参与苯丙烷代谢[15-16]，矮牵牛ODO1(MYB42)能够激活参与番茄中莽草酸途径和苯丙氨酸衍生挥发性化合物的生物合成[17]。【研究切入点】目前，拟南芥等植物中MYB42在木质素代谢调控中具有十分重要的作用，可调控木质素的生物合成，但未见MYB42在烟草中是否具有相似功能的研究报道。【拟解决的关键问题】根据AtMYB序列和烟草MYB转录因子序列，采用同源克隆法分离烟草中的NtMYB42基因，并对基因的结构、编码蛋白理化性质、亚细胞定位和同源性等进行分析，为烟叶品质改良提供参考依据。

本系统利用RS技术和现状图的数据源对1∶10 000比例尺土地进行更新，选择当年的卫星数据（全色3m），同时借助GPS技术将更新范围确定下来。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟草 栽培品种K326，由贵州省烟草科学研究院提供。

国务院于1994年颁布的《种畜禽管理条例》第15、16条规定，生产经营种畜禽的单位和个人，必须向县级以上人民政府畜牧兽医行政主管部门申领《种畜禽生产经营许可证》、申领《种畜禽生产经营许可证》必须具备符合良种繁育体系规划布局要求，所用种禽合格、优良，来源符合技术要求，并达到一定数量，要相应的畜牧兽医技术人员，有相应的防疫措施，有相应的育种资料和记录。因此各级畜牧业兽医行政管理部门只有严格按照《种畜禽管理条例》的规定加强管理，才能及时掌握和了解本地区种畜禽来源、品系情况。从而保证种畜禽品种质量，促进养殖业的健康发展。

1.1.2 试剂与试剂盒 植物组织RNA小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和EasyPure Plant Genomic DNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000 marker、RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、Taq DNA聚合酶和其他分子生物学试剂，购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-T，购自美国Promega公司；引物，由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.2 烟草叶总cDNA获得 以K326叶片总RNA样品0.5 μg为模版，按TaKaRa RNA PCR KitVer.3.0试剂盒说明书进行反转录，反转录后产物即为叶总cDNA。

1.2.1 核酸提取 以K326叶片为材料，按照植物组织RNA小量提取试剂盒和EasyPure Plant Genomic DNA Kit提供的方法提取总RNA和基因组DNA。

从以上分析不难看出，经济是旅游的表象，文化是旅游的本质。从旅游发展史看出，各个时期的旅游活动都有其独特的表现形式及其不同的主题倾向，但在本质上具有一个共同之处，即旅游者在旅游活动中追求的是文化享受③。

1.2.4 生物信息学分析 采用Geneious 4.85对测序序列进行拼接、开放性可阅读框ORF(Open reading frame)查找和翻译以及蛋白质基本性质分析；序列从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载，采用DNAMAN 5.2.2进行序列多重比对、蛋白质转录后修饰预测通过Expasy(http://www.expasy.org)进行在线分析，采用TMHMM[18]、TMpred与Geneious 4.85进行NtMYB42蛋白的跨膜结构预测，采用SignalP[19]进行信号肽分析等。

2 结果与分析

2.1 烟草NtMYB42基因组和cDNA的克隆

测序结果表明，NtMYB42 cDNA和基因组全长分别为1 130 bp和 2 312 bp，含有5′非翻译区(UTR)、2个外显子、1个内含子和3′UTR。其中，5′UTR长度为137 bp，位于基因组序列的1～137 bp，GC含量为31.2%；3′UTR长147 bp，位于基因组序列的2 166～2 312 bp，GC含量为32.0%；第1外显子长度为263 bp，位于基因组序列的138～400 bp，第2外显子长度为583 bp，位于基因组序列的1 585～2 165 bp，2个外显子构成的开放性可阅读框(ORF)为846 bp，GC含量为41.6%；内含子长度为1 182 bp，位于基因组序列的401～1 584 bp，内含子剪切符合“GT-AG”原则(图2)。

2.2 NtMYB42基因的核苷酸序列

电泳结果显示，K326的cDNA和基因组模板经引物NtMYB42-F和NtMYB42-R扩增出约1 100 bp(图1 A)和2 300 bp(图1 B)的特异条带，与预期相符。胶回收转化大肠杆菌后，经菌液PCR检测后挑选阳性克隆子送上海生工有限公司测序。

1.2.3 烟草NtMYB42基因的克隆 以公布的拟南芥MYB42(AtMYB42)转录因子的氨基酸序列为检索序列，利用Geneious 4.85 (Biomatters Ltd.)整合的BLAST程序对所有烟草MYB基因家族160多个基因编码区和基因组序列进行序列多重比对，选择与AtMYB42同源性最高的序列，将其命名为NtMYB42，选择NtMYB42基因的特异位点进行引物设计，设计NtMYB42基因全长cDNA和基因组DNA序列扩增的引物NtMYB42-F(5′-CACCGAGAAAAGTGAGAACTTTACAAGAAAAGTTG-3′)/NtMYB42-R(5′-CTTCCTAGTACTATAGACATGATACATTTG-3′)。以烟草叶片cDNA第一链和基因组总DNA各1 μL为模版，采用50 μL PCR反应体系，扩增NtMYB42基因全长cDNA和基因组DNA序列。PCR扩增cDNA的参数：94℃预变性4 min，35个循环(94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min)，72℃℃保温10 min。基因组DNA扩增时，其延伸的时间增至3 min。将获得的PCR产物胶回收后，连接pGEM-T载体，挑选菌液PCR检测的阳性单克隆子测序。

图1 NtMYB42 cDNA(A)和基因组(B)的PCR扩增图谱

2.3 NtMYB42蛋白的理化性质与转录后修饰位点

施工单位的建造能力水平与造价成本相关，如果施工单位整体的业务能力水平高，则可以降低因缺陷返工等因素造成的额外费用。施工单位业务水平强，可以缩短施工周期，保证建筑产品质量，提升施工单位在建筑市场的形象。

NtMYB42蛋白含有281个氨基酸，分子量为31.79 kD，理论等电点pI为5.18。其中，极性氨基酸95个，比重为37.48%；酸性氨基酸44个，比重为16.67；碱性氨基酸34个，比重为14.49%。NtMYB42蛋白中，亮氨酸(Leu)占比最大，为32个，占整个蛋白序列的11.41%；其次是丝氨酸(Ser)和天冬氨酸(Asp)，均为24个，各占整个蛋白序列的8.54%。NtMYB42蛋白的原子组成为C1380H2185N393O441S14，消光系数在280 nm时为46 115，不稳定系数为47.47，是不稳定蛋白，脂肪系数为79.11，总平均亲水性为-0.642。经NetGly 1.0分析，NtMYB42蛋白存在N174、N184和N2353个可能的N-糖基化修饰位点。经NetPhos分析，NtMYB42中存在14个丝氨酸激酶磷酸化位点、3个苏氨酸激酶磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点(图3)。说明，NtMYB42蛋白能够被激酶所磷酸化，从而实现其功能的调控。NtMYB42蛋白在150～200个氨基酸间存在多个丝氨酸位点，表明在该区域可能存在1个密集的丝氨酸磷酸化调控位点，可作为激酶底物进行体外磷酸化试验证实。

2.4 NtMYB42蛋白跨膜区域与拓扑结构的预测

经TMHMM、TMpred与Geneious 4.85分析，NtMYB42蛋白不存在跨膜结构；经SignalP分析，NtMYB42未发现明显的信号肽剪切位点。NtMYB42的亚细胞定位结果在几个预测工具中差异较大，PSORT预测NtMYB42位于细胞质中，WoLFPSORT则预测NtMYB42位于细胞核中。研究表明，AtMYB42作为转录因子均在细胞核中行使功能，考虑到蛋白N末端序列的保守性，NtMYB42蛋白很可能在细胞核中执行功能，是否在其他细胞结构中存在一定的功能还需要进一步进行亚细胞定位分析。SOPMA对NtMYB42蛋白进行二级结构分析，NtMYB42蛋白中随机卷曲最多，占53.02%，其次是α-螺旋，占32.74%，延伸链和β-折叠分别为7.69%和 6.54%。转录因子MYB功能结构域位于蛋白的 N末端。可见，α-螺旋结构对正确行使 MYB转录因子的绑定功能具有重要意义，这部分位点的突变可能导致功能差异的等位基因出现，对调控下游次生代谢途径基因具有重要作用。

2.5 NtMYB42基因的同源性

将NtMYB42蛋白序列提交至NCBI进行BLAST比对，并下载其他植物同源的MYB42及其他MYB蛋白序列进行多重比对结果表明，NtMYB42蛋白与番茄SlMYB42蛋白〔MYB-like protein ODO1(XP_004245722.1)〕的一致性最高，达82.6%；与矮牵牛PnODO1蛋白的一致性其次，为79.2%；与其他植物MYB42蛋白的一致性也较高，包括葡萄(Vitisvinifera)的VvMYB42(XP_002264150.2)、可可(Theobromacacao)的TcMYB4(EOY24459.1)、杨树(Populustrichocarpa)的PtMYB42(XP_002303526.3)及大豆(Glycinemax)的GmMYB42(XP_003516672.1)等。表明，克隆的MYB42为烟草的MYB转录因子。MYB转录因子DNA绑定结构域基序在所有比对的植物中均十分保守，蛋白质水平多重比对结果(图4)表明，MYB42蛋白在N端极其保守，说明N端与MYB转录因子密切相关。

3 讨论

木质素是烟草细胞壁的主要成分之一，是影响烟株水、有机物和防御系统的关键因素，其含量过高或过低都不利于烟叶生长和品质的形成。在木质素合成代谢途径调控中，NAC蛋白作为主开关协调调控完整细胞壁的形成，包括纤维素、半纤维素和木质素[20]。AtMYB转录因子作为二级调控开关，从多水平转录调控碳通量在木质素和其他类黄酮物质间的流动[21]，因此MYB转录因子对木质素含量精细调控更为重要。AtMYB42在拟南芥木质部组织中优势表达，抑制AtMYB42表达会显著降低木质素生物合成相关基因的表达，在其对应突变体植株中木质素含量显著减少[14]。在拟南芥中过表达ZmMYB42，显著降低S-木质素含量，提高H-木质素和G-木质素含量[21]。研究利用同源克隆策略，从栽培烟草K326中克隆得到NtMYB42基因的全长cDNA和基因组序列，编码281个氨基酸，经BLAST分析，其与其他植物来源的MYB42具有较高的同源性，在蛋白水平与SlMYB42的一致性达82.6%，经与其他植物同源的MYB42及其他MYB蛋白序列多重比表明，克隆的NtMYB42蛋白与番茄MYB-like protein ODO1、矮牵牛PnODO1、其他植物AtMYB42等具有较高的同源性，推测其具有相似功能，说明克隆的NtMYB42基因是木质素代谢途径调控的重要候选基因。NtMYB42在烟草中如何调控木质素生物合成，是否与拟南芥中直接调控MYB4抑制其他竞争代谢途径以优化木质素生物合成，从而控制碳流入苯丙酸途径相同，还需要进一步深入研究。

4 结论

从栽培烟草K326中克隆得到NtMYB42基因的全长cDNA和基因组序列，编码281个氨基酸。NtMYB42与其他植物来源的MYB42具有较高的同源性，是番茄SlMYB42、矮牵牛PnODO1和拟南芥AtMYB42的同源基因，推测其具有相似功能即调控烟草木质素生物合成途径，可为烟草品质改良提供参考依据。

DOI：10.3389/fpls.2017.00943.

DOI：10.1038/srep28502.

DOI：10.1056/NEJM199001043220121.

DOI：10.1038/ncomms9635.