LncRNA H19、miR-29a水平与冠心病病人Gensini积分的相关性分析

仉慧颖，耿 威

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，是常见的心血管疾病[1]。2015年全球约1 700多万例病人死于心血管疾病，占死亡人数的1/3[2]。我国每年冠心病死亡率约0.111%，已成为严重威胁公民健康的重大卫生问题之一[3]。随着人口老龄化程度加重，冠心病发病率逐年升高[4]。有研究表明，吸烟、酗酒、肥胖、高血压、糖尿病均可能引起冠心病，但具体发病诱因尚不明确[4]。冠心病的发生是多细胞参与、多基因调控的复杂病理过程，微小RNA(miRNA)和长链非编码核苷酸(LncRNA)等广泛参与心血管疾病的发生过程。有研究表明，血管内皮细胞缺氧条件下LncRNA H19表达上调[5]，提示LncRNA H19可能参与血栓发生后心肌细胞缺氧调控反应。崔涛等[6]研究表明，心力衰竭病人外周血miR-29a表达上调，与心肌功能和心肌重构关系密切，提示miR-29a表达水平可能与心肌功能有关。Gensini积分用于评价冠状动脉狭窄程度具有广泛的应用价值[7]。但冠心病病人血清LncRNA H19和miR-29a表达水平及与Gensini积分的关系尚不明确。本研究通过探讨冠心病病人血清LncRNA H19和miR-29a表达，分析二者与冠状动脉Gensini积分的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 纳入与排除标准 纳入标准：冠状动脉造影显示至少1支冠状动脉血管狭窄≥50%；病人及家属对本研究知情同意并自愿签署知情同意书；病人入院后临床资料完整。排除标准：合并恶性肿瘤病人；近1个月内行外科手术或严重创伤；自身免疫缺陷、合并免疫性疾病；合并中度感染；滥用药物史或嗜酒。

1.1.2 研究对象 选取2018年2月—2019年2月我院就诊的符合纳入标准的冠心病病人86例作为冠心病组，另选取我院同期体检健康者60名作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集及样本采集 收集所有研究对象年龄、性别、体质指数(body mass index，BMI)、吸烟史等临床资料。抽取所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL于试管中，4 ℃条件下，以5 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.2.2 血清LncRNA H19、miR-29a水平检测 取血清，以Trizol试剂盒(索莱宝公司)提取血清总RNA，总RNA提取后检测纯度及完整性。采用定量反转录试剂盒(TOYOBO公司)将2 μg总RNA反转录为cDNA，参考SYBR Green PCR master mix试剂盒(大连宝生物公司)说明加配荧光定量聚合酶链式反应(PCR)体系，每个样本设置3次重复；体系加配完成后放入荧光定量PCR仪(型号：bio-rad cfx manager，bio-rad公司)。反应结束后收集实验数据，LncRNA H19以β-actin为内参基因，miR-29a以U6为内参基因，引物序列详见表1。采用2-ΔΔCt计算两组血清LncRNA H19和miR-29a相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列(5′-3′)

1.2.3 冠状动脉Gensini积分计算方法 应用Artis Zee Ceiling数字减影血管造影仪(西门子)行冠状动脉造影，参考Zeller等[7]的研究方法对冠状动脉血管狭窄程度进行评定，根据冠状动脉狭窄程度进行评分，狭窄直径<25%计1分，25%～50%计2分，51%～75%计4分，76%～90%计8分，91%～99%计16分，100%计32分，根据不同冠状动脉分支确定相应系数，左主干×5；左前降支：近段×2.5，中段×1.5，远段×1；对角支：D1×1，D2×0.5；左回旋支：近段×2.5，钝缘支×1，远段×1，后降支×1，后侧支×0.5；右冠状动脉近段、中段、远段和后降支均×1。以每支冠状动脉狭窄基本评分乘以系数之和计算病人冠状动脉狭窄程度Gensini积分。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、BMI、吸烟、糖尿病、高脂血症比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组血清LncRNA H19、miR-29a水平比较 冠心病组血清LncRNA H19、miR-29a水平均高于对照组(P<0.01)。详见表3。

表3 两组血清LncRNA H19、miR-29a水平比较(±s)

2.3 两组Gensini积分比较 冠心病组Gensini积分高于对照组(P<0.01)。详见表4。

表4 两组Gensini积分比较(±s) 单位：分

2.4 LncRNA H19、miR-29a表达水平与冠心病病人Gensini积分相关性分析 Pearson相关性分析结果显示：LncRNA H19、miR-29a与冠心病病人Gensini积分呈正相关(r=0.525，P<0.001；r=0.523，P<0.001)。详见图1。

图1 LncRNA H19、miR-29a表达水平与Gensini积分相关性分析散点图(A为LncRNA H19与Gensini积分的相关性分析；B为miR-29a与Gensini积分的相关性分析)

2.5 影响冠心病病人Gensini积分的多重线性回归分析 多重线性回归分析显示，LncRNA H19、miR-29a是影响冠心病病人Gensini积分的因素。详见表5。

表5 影响冠心病病人Gensini积分的多重线性回归分析

3 讨 论

冠状动脉粥样硬化导致血管管腔狭窄或阻塞引起心肌缺血是心脏病的直接原因[4]。动脉粥样硬化是复杂的慢性炎症疾病，主要由血管内皮细胞、单核巨噬细胞、平滑肌细胞参与，以脂质成分在冠状动脉管壁沉积为特征，形成动脉粥样斑块，斑块破裂脱落形成血栓，堵塞血管导致心肌缺血诱发心脏病[8]。有研究显示，多种LncRNA和miRNA参与心血管疾病的发生及调控过程[9]，对心血管疾病的诊断和治疗有积极意义。

LncRNA是一类长度>200 NT的长链非编码内源RNA，通过与靶基因mRNA形成复杂的三维结构调控靶基因表达，也可结合蛋白质形成RNA-蛋白复合体，影响蛋白质功能，与mRNA互补结合发挥调控功能，提示LncRNA通过多种互作机制抑制或激活基因表达[10]。有研究表明，LncRNA Bvrt、Fendrr、ANRIL、MIAT、Mhrt等参与心血管发育、心肌梗死、心肌病等过程[11]，提示LncRNA在心血管疾病中发挥重要作用。相关研究表明，LncRNA H19通过抑制let-7a使细胞周期蛋白d1表达上调促进血管重塑[12]，提示LncRNA H19表达水平与血管生成有关。Voellenkle等[5]研究发现缺氧条件下，血管内皮细胞LncRNA H19表达上调。本研究结果显示，冠心病病人血清LncRNA H19表达上调，提示LncRNA H19可能参与冠心病发病过程。多种miRNA与动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病发生及调控过程有关[9]，提示miRNA在心血管疾病发展中发挥重要的调控作用。Ntelios等[13]研究结果显示miR-29a在肥厚型心肌病病人心肌组织表达上调，与肥厚型心肌纤维化过程有关，推测miR-29a可能参与冠心病发病过程。本研究结果显示，冠心病病人血清miR-29a表达水平高于对照组，提示miR-29a可能参与冠心病发生过程。

Gensini积分是冠状动脉狭窄程度的重要评价指标，积分越高提示越狭窄[7]。冠心病与冠状动脉狭窄有关。本研究结果显示，冠心病组Gensini积分高于对照组，提示冠心病病人存在不同程度冠状动脉狭窄。本研究Pearson相关性分析结果显示，LncRNA H19、miR-29a表达水平与Gensini积分呈正相关，提示LncRNA H19、miR-29a高表达可能参与冠心病病人冠状动脉狭窄病变，推测LncRNA H19、miR-29a可能是影响冠心病病人冠状动脉狭窄病变程度的指标。以往研究结果显示，吸烟史、肥胖、高脂血症是动脉粥样硬化的影响因素[4]，推测吸烟史、肥胖、高脂血症可能是冠心病病人Gensini积分的相关因素。本研究多重线性回归分析结果显示，LncRNA H19、miR-29a是影响冠心病病人Gensini积分的重要相关因素。Pan[14]研究表明，LncRNA H19通过调控MAPK和核转录因子-κB通路促进冠状动脉粥样硬化进程，提示冠心病病人LncRNA H19表达上调，可能促进动脉血管粥样硬化，影响冠心病病人Gensini积分。动脉粥样硬化病人miR-29a高表达，并促进动脉粥样硬化发生[15]，提示miR-29a可能通过促进动脉血管粥样硬化，加剧动脉血管狭窄。BMI和血脂水平越高，可能加快动脉粥样硬化的发生过程[16]，间接影响冠心病病人动脉血管粥样硬化和狭窄程度。He等[17]研究表明，LncRNA H19竞争性抑制miR-29a-3p调控E2F1表达，参与肾透明性细胞癌进展过程，提示LncRNA H19可能与miR-29a存在竞争抑制调控关系，有待今后研究进一步验证。

综上所述，冠心病病人血清LncRNA H19、miR-29a表达上调，二者均与Gensini积分呈正相关，LncRNA H19、miR-29a是影响冠心病病人Gensini积分的重要因素。但LncRNA H19、miR-29a对冠心病病人Gensini积分的影响机制有待进一步研究证实。