外源保幼激素对中华通草蛉滞育解除及滞育后发育的影响

黄海艺, 赵月明, 武晓亮, 陈珍珍, 许永玉,*

(1. 山东农业大学植物保护学院, 山东泰安 271018; 2. 泰安市农业科学研究院, 山东泰安 271000)

中华通草蛉Chrysoperlasinica在我国分布范围广、捕食量大、繁殖力强、发生期长，具有重要的生防价值。为发挥其生防优势，大规模工厂化繁殖及人工田间释放是十分必要的。滞育是昆虫生长、发育、繁殖的静止状态，是昆虫应对不利环境条件适应和选择的重要生理对策(Tauberetal., 1986; Danks, 2002)。中华通草蛉为多化性昆虫，在自然界中以成虫兼性滞育越冬，滞育的诱导与解除具有一定的可塑性。前期研究发现，短光周期处理成虫即可诱导中华通草蛉滞育而导致成虫历期的延长(Chenetal., 2017)。短光周期处理的中华通草蛉活动能力较弱，取食较少，种群抗逆能力较强，这对于天敌昆虫的长期存储研究是有意义的。许多昆虫滞育的解除需要严格的外界条件或需花费一定的时间(Koštáletal., 2000; 徐卫华, 2008; 陈珍珍等, 2013b, 2013c)。与非滞育成虫相比，中华通草蛉需要相对较长时间的长光照处理才能解除滞育恢复产卵。因此，在实际应用中，根据生产和科研的需要，如何调控成虫滞育的快速解除过程，是利用滞育成虫来进行长期存储应用中亟待解决的关键问题。

保幼激素(juvenile hormone, JH)可刺激滞育雌、雄成虫的生殖发育，外源JH的使用抑制多数昆虫的生殖滞育(Herman and Dallmann, 1981; Eizaguirreetal., 1998; Watanabe and Tanaka, 2000)。目前国内外有关JH的代谢、合成、测定及分子作用机制的研究相对较成熟(李胜等, 2004; 嵇保中等, 2007; 刘艳等, 2007; 周树堂等, 2012)，对生殖发育的调控也有较多报道(Lietal., 2011; Shengetal., 2011)。许多学者研究均发现，JH或JH类似物处理滞育成虫均能引起成虫滞育的终止及雌成虫产卵期的提前(Kidokoroetal., 2006; Choetal., 2007)，且RNA干扰技术的应用更加明确了JH对昆虫生殖发育过程中的促进作用(Kangetal., 2014; Smykaletal., 2014; Luoetal., 2017)。这说明利用外源JH刺激可调控成虫滞育解除的过程。Okuda等(1996)的研究还发现，一定量的JH类似物处理蝗虫成虫会促进其生殖系统的发育，而超量的JH则会抑制成虫生殖系统的发育，说明JH使用量、使用时期不同均会诱导昆虫产生不同的生理响应。

本研究通过点滴外源JH诱导中华通草蛉滞育解除，观察对其滞育后发育的影响，为进一步从根本上解决中华通草蛉滞育解除时间长、生殖发育恢复较慢的难题，使滞育解除不再是滞育虫态存储利用中的制约因素，同时也为其他天敌昆虫的存储及应用研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试虫选择及滞育判断标准

中华通草蛉自然越冬成虫于10月中旬开始进入滞育(牟吉元等, 1980)，通过解剖观察卵巢发育级别判断11月中旬几乎所有成虫个体均进入深度滞育(许永玉等, 2002)。根据许永玉等(2002)的研究结果，中华通草蛉的成虫体色由滞育型土黄色变为非滞育型绿色并开始产卵，表明成虫已解除滞育。

实验用中华通草蛉越冬滞育成虫于10月份网捕于山东农业大学校园内大叶黄杨Buxusmegistophylla上。采集的成虫置于罐头瓶(高11 cm，直径9 cm) 中，用纱布封口。一部分置于室外人工棚内自然越冬，另一部分置于温度25±1℃、相对湿度60%±5%、光周期15L∶9D的人工气候室(RSZ智能人工气候室，江苏常州国华)饲养，连续饲养3代后建立稳定室内种群。成虫饲喂啤酒酵母干粉饲料[ 将啤酒酵母干粉和蔗糖按10∶8的比例(v/v)混合，用研钵研细后过60目筛制成]和10%蜂蜜水。

1.2 不同剂量的外源JH处理对中华通草蛉自然越冬种群滞育后发育的影响

于11月15日随机选取室外人工棚内体色均为土黄色且体形、大小基本一致的中华通草蛉成虫，手持微量点滴器点滴不同剂量(5, 15, 25和35 μg/成虫)的外源JH 1 μL于中华通草蛉雌成虫腹部第3节背面，当前实验剂量下中华通草蛉成虫存活率为100%。外源JH购买于多伦多研究化学公司(Toronto Research Chemicals，产品目录号E589400，纯度95%)，用丙酮(纯度为90%～95%)稀释成不同浓度。对照(CK)只点滴丙酮。点滴后的雌、雄成虫单头配对放入罐头瓶内，置于温度25±1℃、相对湿度60%±5%、光周期15L∶9D的人工气候室(RSZ智能人工气候室，江苏常州国华)饲养，每日检查记录成虫的存活情况、产卵前期、产卵历期、产卵量和雌成虫寿命，每处理15对成虫。参照陈珍珍等(2013a)的方法，产卵前期是指从开始处理至成虫开始产卵的时间即滞育解除需要的时间；产卵历期是从开始产卵至产卵结束的时间；雌成虫寿命是指从开始处理至处理成虫死亡的时间。

1.3 外源JH处理不同日龄中华通草蛉滞育成虫对其滞育后发育的影响

收集中华通草蛉连续饲养3代后建立稳定室内种群卵，置于温度25±1℃、相对湿度60%±5%、光周期9L∶15D的光照培养箱内(LRH-150-G光照培养箱，广东省医疗器械厂)饲养。幼虫饲养方法参照Chen等(2017)，幼虫孵化后单头置于指形管中，在相同的环境条件下饲喂新鲜豆蚜Aphiscraccivora直至化蛹。成虫羽化后单头配对于罐头瓶中并置于9L∶15D的光照培养箱中继续饲养。分别于成虫羽化后第0, 5， 10, 20, 30和40天(即0, 5， 10, 20, 30和40日龄滞育成虫)，手持微量点滴器点滴15 μg/成虫外源JH于中华通草蛉雌成虫腹部背面，以未点滴外源JH的相同滞育诱导时间的成虫为对照。后转于温度25±1℃、相对湿度60%±5%、光周期15L∶9D的人工气候室(RSZ智能人工气候室，江苏常州国华)，每日检查记录成虫的存活情况、产卵前期、产卵历期、单雌产卵量和雌成虫寿命。每处理重复15对成虫。

1.4 数据分析

利用统计软件SPSS19.0对试验所得数据进行统计分析，获得平均值及标准误。所得数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)；对不同处理间的差异进行Tukey氏HSD多重比较分析，两组数据之间的差异性比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同剂量的外源JH处理对中华通草蛉成虫滞育解除及滞育后发育的影响。

随着外源JH处理剂量的提高，成虫产卵前期呈先下降后上升的变化趋势(图1: A)。对照组产卵前期最长，为11.55±0.78 d，点滴外源JH的处理组其产卵前期均显著短于对照组[F(4,70)=7.809;P<0.001]，其中15和25 μg/成虫JH处理组产卵前期最短，分别为6.43±0.31 d和6.29±0.35 d。与对照组相比，点滴外源JH处理能显著加快滞育解除速度。

图1 不同剂量的外源保幼激素处理对中华通草蛉滞育成虫产卵前期(A)、产卵历期(B)、雌虫寿命(C)和单雌产卵量(D)的影响Fig. 1 Effects of different doses of exogenous juvenile hormone (JH) on the pre-oviposition period (A), oviposition duration (B),female longevity (C) and number of eggs laid per female (D) of diapause adults of Chrysoperla sinica CK: 点滴丙酮对照Topical application of acetone as the control. 图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母代表不同剂量处理间在0.05水平上差异显著(P<0.05, Tukey氏HSD多重比较)。Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant differences between different treatment doses (P<0.05, Tukey’s HSD test).

成虫产卵历期则随着外源JH点滴剂量的增加，呈先升高后下降的趋势(图1: B)。除35 μg/成虫处理组外，其他浓度外源JH处理组产卵历期均显著长于对照组[F(4, 62)=5.500;P<0.001]。15 μg/成虫处理组产卵历期最长，为72.47±5.76 d；对照组产卵历期最短，为37.78±3.84 d。15 μg/成虫外源JH处理中华通草蛉产卵历期比对照组约延长1.94倍。

雌虫寿命随着外源JH点滴剂量的增加，呈先升高后下降的趋势(图1: C)。15 μg/成虫JH处理组雌虫寿命最长，为85.47±6.11 d， 35 μg/成虫JH处理组雌虫寿命最短，为44.7±7.07 d。15 μg/成虫JH处理组的雌虫寿命显著长于对照和35 μg/成虫JH处理组[F(4, 67)=5.586;P<0.001]。与对照相比，15 μg/成虫外源JH处理的中华通草蛉雌虫寿命延长了约30%。

随着外源JH点滴剂量的增加，成虫单雌产卵量呈先升高后降低的变化趋势(图1: D)。15 μg/成虫JH处理组产卵量最多，为327.82±6.11粒；对照组产卵量最少，为153±4.16粒。15 μg/成虫JH处理组产卵量显著高于对照组和35 μg/成虫外源JH处理组[F(4, 64)=3.932;P=0.006]。与对照组相比，15 μg/成虫JH处理组的产卵量增加了约113.72%；35 μg/成虫JH处理组产卵量与对照组比较无显著差异(P=1.000)。

2.2 外源JH处理对不同日龄中华通草蛉滞育成虫滞育后发育的影响

与作对照的未经外源JH处理的中华通草蛉成虫相比，点滴15 μg/成虫外源JH处理的中华通草蛉滞育成虫的产卵前期显著缩短，即滞育解除速度显著加快(图2: A)。处理滞育成虫日龄为0, 5, 10和20日龄时，处理组与对照组产卵前期均有极显著性差异(0日龄:t=5.452,df=27,P<0.001; 5日龄:t=4.576,df=38,P<0.001; 10日龄:t=5.186,df=22,P<0.001; 20日龄:t=8.390,df=19,P<0.001)。处理日龄为20日龄时，外源JH处理组的产卵前期比对照组缩短11 d，缩短约70%。

未经外源JH处理的对照组中华通草蛉滞育成虫的产卵历期随着处理日龄的增加呈逐渐下降趋势(图2: B)。15 μg/成虫外源JH处理组的产卵历期随着处理日龄的增加，先升高后下降。处理日龄为0日龄时，处理组的产卵历期极显著短于对照组(t=3.524,df=33,P=0.001)，其他日龄则外源JH处理组和对照组间无显著性差异(5日龄:t=1.522,df=36,P=0.137; 10日龄:t=0.261,df=31,P=0.796; 20日龄:t=0.253,df=34,P=0.802; 30日龄:t=2.106,df=32,P=0.053; 40日龄:t=1.081,df=30,P=0.288)。

未经外源JH处理的对照组中华通草蛉滞育雌成虫寿命随着处理日龄的增加，呈先下降后上升再下降趋势(图2: C)。15 μg/成虫外源JH处理组的雌虫寿命随着处理日龄的增加，先升高后下降。处理日龄为0日龄时，处理组的雌虫寿命极显著短于对照组(t=3034,df=33,P=0.004);处理日龄为5日龄和40日龄时，处理组的雌虫寿命极显著长于对照组(5日龄:t=-3.380,df=39,P=0.001; 40日龄:t=-3.270,df=31,P=0.002)；其余日龄处理组和对照组间雌虫寿命无显著性差异(10日龄:t=0.012,df=31,P=0.0.991; 20日龄:t=0.237,df=34,P=0.814; 30日龄:t=0.708,df=32,P=0.484)。

单雌产卵量均随着处理日龄的增加，呈先上升后下降趋势(图2: D)。除了0日龄，其余日龄的15 μg/成虫外源JH处理组产卵量均显著低于对照组(5日龄:t=2.357,df=23,P=0.026; 10日龄:t=2.686,df=23,P=0.013; 20日龄:t=2.381,df=23,P=0.025; 30日龄:t=3.568,df=24,P=0.001; 40日龄:t=2.255,df=28,P=0.032)。

3 讨论

3.1 JH对昆虫滞育解除的促进作用

JH信号调节短光周期诱导的昆虫冬季的生殖滞育(Denlinger and Armbruster, 2014)。前人研究发现，在滞育诱导期滴加外源JH可推迟昆虫进入滞育，已经进入滞育的昆虫点滴外源JH，可以暂时解除昆虫滞育，并促进卵巢发育恢复生殖(Denlingeretal., 2012; 高俏等, 2018)。本研究发现，点滴外源JH对中华通草蛉滞育的解除有一定的促进作用，且滞育解除的速度(产卵前期)随着剂量增大逐渐加快，表现出一定的剂量效应(图1)。对马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata处理也发现了相似的变化趋势，即不同滞育深度的马铃薯甲虫点滴JH及其类似物后转入长光照下，相对于对照组显著缩短了产卵前期，且滞育解除率随着剂量增大而增大(Schooneveldetal., 1977)。同样地，给滞育的三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus成虫和黄蛱蝶Polygoniacaureum点滴外源JH或类似物烯虫酯(methoprene)，均能够能刺激雌虫卵巢发育并促进滞育解除(王瑜等, 1994; Hiroyoshietal., 2017)。不同剂量外源JH点滴处理后，综合产卵前期、产卵历期、单雌产卵量和雌虫寿命研究结果， 15 μg/成虫的外源JH剂量是深度滞育的中华通草蛉自然越冬种群快速解除滞育的最佳剂量。此时滞育解除最快，产卵量最高，成虫寿命和产卵历期最长。

对不同滞育时期的丽蝇Melindapusilla点滴JH类似物烯虫酯，相同的剂量下越冬滞育维持时期使用，短暂促进卵巢发育但不形成成熟卵，而在越冬滞育解除时使用超过80%个体开始产卵，说明外源JH在不同滞育时期促进滞育解除的作用是不一样的(Aguietal., 1991)。中华通草蛉属短日照滞育型，光周期是诱导滞育的主要因素，成虫是滞育诱导的敏感虫态，在光周期为9L∶15D的短光周期条件下诱导，滞育率为100%(Xuetal., 2004)。在前期研究中，短光周期下饲养的中华通草蛉成虫均出现明显的滞育表型和生殖延迟，即短光周期诱导的中华通草蛉种群均可进入滞育(Chenetal., 2017)。滞育强度通常用给定的条件下结束滞育所需要的时间表示(Danks, 1987)。本研究发现，中华通草蛉在25℃短光周期处理条件下，20日龄滞育成虫处理组产卵前期最长，说明此时程度最深；其次，超过30日龄的滞育成虫，未点滴外源JH的对照组和点滴外源JH处理组都出现产卵前期急剧下降(图2: A)，说明已经由深度滞育转为逐渐解除滞育；最后，不同日龄的滞育成虫点滴外源JH对中华通草蛉的滞育解除均有一定的促进作用，且20日龄滞育成虫产卵前期缩短11 d(缩短了约70%)(图2: A)。

3.2 JH对昆虫生殖的调节作用

昆虫在性成熟过程中遇到的外源或者内源激素的变化对成虫均有较大的影响(Gruntenkoetal., 2010)。用JH或类似物烯虫酯处理的雄性果蝇，促进其释放性信息素并在较年轻时交配，说明JH控制生殖成熟和性信号传导(Tealetal., 2000)。前人研究还发现，JH对发育中的神经回路的建模有直接影响(Malaterreetal., 2003)，对蜜蜂的研究也表明，JH对发育成熟的成虫行为所需的神经可塑性很重要(Fahrbach and Robinson, 1996)。本研究中，初羽化成虫立即雌雄配对放入一个罐头瓶中，然后对其进行不同时间的短光周期诱导滞育处理，点滴外源JH后显著缩短了其产卵前期，在此过程中是否由于JH含量的增加触发了其雌、雄交配行为提前而导致的生殖提前，还需要进一步证实。

JH是引发卵巢发育及卵黄发生所必需的，但也有一定的剂量效应。随着JH点滴剂量的增加，成虫产卵量呈先升高后下降的变化趋势，且以15 μg/成虫的处理组产卵量最多，显著高于对照组(图1: D)，说明适宜剂量的外源JH处理可刺激昆虫生殖能力的提高。利用JH类似物处理昆虫同样证明了这一点，低剂量的苯氧威(fenoxycarb)处理红蝽Dysdercussimilis促进卵黄生成增加，高剂量处理则抑制卵黄生成和绒毛膜形成，导致卵母细胞萎缩(Govind, 2014)，利用蚊蝇醚处理西方蜜蜂Apismellifera工蜂也会出现低浓度可导致卵黄原蛋白Vg在血淋巴中的发生和积累，而高浓度可抑制Vg蛋白的合成的现象(Pintoetal., 2000)。JH类似物(JHA)对滞育的大猿叶甲Colaphellusbowringi成虫的卵巢发育有明显的促进作用(Liuetal., 2016)。外源JH处理不同日龄的中华通草蛉滞育成虫，其产卵量相对于未点滴外源JH处理的中华通草蛉显著降低(图2: D)。从点滴15 μg/成虫外源JH的成虫产卵量显著高于对照的结果来看，可能是由于处理不同日龄的对照组未点滴丙酮作为对照，说明丙酮对于中华通草蛉有一定的毒性，在使用过程中应换其他的方法对JH进行稀释。但通过生殖力变化趋势可以发现，滞育诱导20 d之前解除滞育其生殖能力较高，甚至高于对照未经滞育诱导的成虫，而20 d之后则生殖力开始下降，证明了短时间的滞育诱导可提高其成虫的生殖能力。

Medina等(2003a, 2003b)的研究结果表明，田间最大剂量的JH类似物(蚊蝇醚)处理普通草蛉Chrysoperlacarnea发现，虽然其对成虫生命力和产卵力没有影响，但在雌虫卵黄沉积时处理则会影响其幼虫孵化率。因此，虽然我们研究了点滴JH对中华通草蛉滞育后发育的影响，但JH是否影响中华通草蛉滞育后的卵质量、卵孵化率和子代发育等，这些工作需要进一步展开。而在天敌保育方面中，本研究结果解决了中华通草蛉滞育解除耗费时间长的瓶颈问题，为成虫滞育天敌的高效存储利用与滞育的快速解除提供了新思路。

3.3 结论

综合考虑对生殖能力各项指标和雌虫寿命的影响，认为15 μg/成虫的外源JH剂量是中华通草蛉滞育快速解除的最佳使用剂量。最佳使用时期为滞育20 d的成虫，此时点滴外源JH对中华通草蛉成虫滞育解除后的生殖能力影响最小。