宽胸理肺汤合三子养亲汤对COPD大鼠炎症因子、氧化应激及凋亡相关蛋白的影响

薛经纬，陶智会，李 勇，朱 毅

(1. 上海市嘉定区中医医院，上海 201800；2. 上海市中医医院，上海 200071)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)属于一种可防可治的疾病，常由于长期暴露于有害颗粒或气体使气道和/或肺泡异常所致。该病的主要特点是气流受限与呼吸道症状，同时具有病情迁延不愈、症状常年存在及易反复发作等特征。目前，COPD的发病机制尚未完全明了，但多数观点认为与气道与肺部的慢性炎症、氧化抗氧化系统失衡、支气管及肺泡上皮细胞凋亡等因素有关。虽然现阶段针对COPD采取的治疗措施可以改善患者临床症状，但无法有效抑制病情进展，所以进一步明确COPD病机非常重要。方邦江教授通过长期的临床实践认为“痰浊壅肺证”是COPD的主要证型之一，治疗上应以理肺、化痰、祛瘀立法，辨证论治，尽可能祛除外邪，改善症状，防止病情加重，使患者快速进入稳定期，故而创立了由瓜蒌薤白半夏汤、二陈汤、三拗汤组成的宽胸理肺汤，临床应用疗效确切。而三子养亲汤是医治气滞痰壅的经典名方，具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。课题组前期临床研究结果表明，宽胸理肺汤合三子养亲汤治疗COPD急性加重期痰浊壅肺证患者，能有效抑制全身炎症反应,降低白细胞计数、中性粒细胞比例及血清炎症因子水平，改善肺功能和临床症状体征[1-2]。为进一步证实宽胸理肺汤合三子养亲汤的有效性及探讨其作用机制，本课题组采用烟熏加气管注内毒素法诱导的COPD大鼠模型进行了研究，现将结果报道如下。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 雄性清洁级Wistar大鼠42只，体重180～220 g，购自上海实验动物中心,动物合格证号：2018000529121。清洁级动物房饲养，(25±2)℃恒湿，人工光照12 h、黑暗12 h，自由进食饮水。

1.2实验药物及制备 宽胸理肺汤合三子养亲汤药物组成：麻黄9 g、杏仁12 g、全瓜蒌30 g、薤白12 g、半夏10 g、橘红6 g、茯苓15 g、甘草6 g、桃仁10 g、地龙9 g、苏子10 g、莱菔子10 g、白芥子10 g。用自动煎药机煎煮成200 mL汤药，浓缩4倍，按实验所需浓度稀释。

1.3主要试剂和仪器 Bax、Bcl-2抗体(Santa Cruz公司)， Caspase-3、Caspase-9抗体(Abcam公司)，辣根酶标记山羊抗鼠、兔IgG(cell signaling technology公司)，β-actin抗体(cell signaling technology公司)，白细胞介素-6(IL-6)、 白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD) ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，内毒素(LPS)购自Sigma公司。Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机(Heal force公司)，Var10skan Flash荧光酶标仪(Thermo scientific公司)，Wellwash 4 mk 2型洗板机(Labsystems dragon公司)，JX-FSTPRP-48型电动匀浆机(上海净信公司)， 微型垂直电泳、电转移系统、ChemiDocTM XRS+ 自动显影系统。

1.4实验方法 取7只健康雄性Wistar大鼠作为正常组，每天正常呼吸新鲜空气，于实验第1天及第14天时麻醉大鼠后给予生理盐水气管内滴注；余35只大鼠参考文献[3]，采用烟熏加气管滴注LPS法制备COPD模型：在染毒箱内被动吸烟12支/(次·d)，染毒时间为30 min，其余时间呼吸新鲜空气，在实验第1天及第14天时麻醉大鼠后在气管内滴注200 μL LPS水溶液(1 mg/mL)，滴注过程需缓慢，滴注日不进行染毒操作。连续烟熏28 d后，验证模型制备成功。将建模成功大鼠随机分成COPD组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、乙酰半胱氨酸组，每组7只。中药高、中、低剂量组分别按照5，2.5，1.25 g生药/kg的剂量(为临床用药的2，1，0.5倍)给予宽胸理肺汤合三子养亲汤灌胃，乙酰半胱氨酸组给予乙酰半胱氨酸0.8 g/kg(为临床用药的1倍)灌胃，药物均用0.5%羧甲基纤维素钠配制；正常组和COPD组分别给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃；均1次/d，持续28 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1血清炎症因子及氧化应激指标 各组大鼠在末次灌胃后24 h，用10 mg/mL的戊巴比妥钠麻醉后，解剖开胸经心脏采集血液，常温下以3 500 r/min的速度进行离心，10 min后取血清放至EP管中，随后保存在-20 ℃冰箱,采用ELISA法检测血清IL-6、 IL-8、TNF-α、MDA、SOD水平。

1.5.2肺组织病理组织学观察 取部分大鼠肺组织，放置于4%多聚甲醛液中进行组织固定，梯度浓度酒精逐步脱水，用石蜡包埋组织，4～7 μm切片，经HE染色后在光学显微镜下进行大鼠肺组织形态学观察。

1.5.3肺组织中凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达检测 参考文献[4],采用Western blot法检测：取用锡纸包裹后放至-80 ℃冰箱保存的部分肺组织，加入RIPA裂解液，随后经组织均浆、超声裂解、低温高速离心、抽取上清等操作提取组织蛋白，经过BCA蛋白定量后按调定的蛋白比例加入5×上样缓冲液，煮沸变性待测。将蛋白样本经凝胶电泳分离后电转移至NC膜上，随后进行封闭、洗涤、一抗孵育(2%BSA稀释至1∶500～1∶1 000)、洗涤、二抗孵育(5%脱脂奶粉稀释至1∶1 000～1∶2 000)、洗涤、显影等操作，最后使用ChemiDocTMXRS+凝胶成像分析系统进行蛋白半定量分析，用目的蛋白/内参蛋白的光密度值比率来表示目的蛋白的相对表达量，采用Graphpad 9.0软件制成柱状图。

2 结 果

2.1各种大鼠血清炎症因子IL-6、 IL-8、TNF-α水平比较 COPD组大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平均显著高于正常组(P均<0.05)，中药各组及乙酰半胱氨酸组大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平均显著低于COPD组(P均<0.05)；中药高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8水平明显低于乙酰半胱氨酸组(P均<0.05),TNF-α水平明显高于乙酰半胱氨酸组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平比较

2.2各组大鼠血清SOD、MDA水平比较 COPD组大鼠血清MDA水平显著高于正常组(P<0.05)，SOD水平显著低于正常组(P<0.05)；中药各组及乙酰半胱氨酸组大鼠血清MDA水平显著低于COPD组(P均<0.05)，血清SOD水平显著高于COPD组(P均<0.05)；中药高剂量组血清MDA水平显著低于乙酰半胱氨酸组(P<0.05)，血清SOD水平显著高于乙酰半胱氨酸组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清SOD、MDA水平比较

2.3各组大鼠肺组织病理学表现 正常组大鼠支气管管腔通畅，上皮细胞排列整齐，无杯状细胞增生，未见上皮细胞鳞状化生，管腔及周围血管未见炎性细胞聚集浸润；COPD组大鼠小气道管腔明显狭窄，结缔组织增生，支气管管壁增厚，黏液细胞增多，部分可见黏液堵塞气道，肺泡结构紊乱，上皮细胞不同程度皱缩破坏，管腔及周围血管可见中性粒细胞聚集；与模型组比较，中药各组及乙酰半胱氨酸组大鼠气道上皮细胞脱落、炎症细胞浸润、杯状细胞增多以及肺气肿形成等现象均有不同程度减轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色病理学表现(×100)

2.4各组大鼠肺组织中凋亡相关蛋白表达量比较COPD组大鼠肺组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均显著高于正常组(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著低于正常组(P<0.05)；中药各组及乙酰半胱氨酸组大鼠肺组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均显著低于COPD组(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量均显著高于COPD组(P均<0.05)。见图2。

3 讨 论

COPD属于一种可防可治的疾病，其具有异质性，早期有效干预能够延缓病情发展，改善预后，提高患者的生活质量。我国流行病学调查显示，40岁以上人群COPD的患病率已达13.7%，60岁以上人群患病率高达27%，相较于2007年升高近1倍，而目前我国COPD致死致残人数约占全球的30%[5]。COPD的病因多样，一般认为与吸烟、粉尘接触、大气污染、家族遗传、性别及年龄、肺生长发育异常等相关。随着研究的深入，学者们对COPD的发病机制提出了氧化应激、气道重塑以及气道炎症等多种假说。 巨噬细胞、中性粒细胞分泌的增多与COPD的炎症具有直接的关联，此类炎性细胞可分泌炎症介质与细胞因子，通过氧化应激等机制激活，损伤气道，破坏肺实质，使气道重塑，从而引发气流受限。COPD形成、发展的核心是气道炎症，气道炎症和气流受限、肺气肿、肺功能恶化等密切相关，炎症加重可使病情恶化[6-7]，同时也会影响COPD急性加重的频率[8]，因此抑制炎症反应是COPD治疗的核心。TNF-α的生物作用有两种，其属于一种免疫防护介质，可以保护机体，但如其表达异常也会损伤机体免疫，导致 NF-κB激活，使机体反复出现气道炎症[9]。王慧敏等[10]研究发现，中性粒细胞、巨噬细胞等细胞被激活后分泌大量的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8 等，引发机体炎症反应，损伤支气管、肺组织。而在炎症刺激作用下，细胞内线粒体呼吸链中断，会产生大量活性氧自由基，过量活性氧自由基会导致脂质过氧化损伤，增加细胞膜的通透性并使其流动性降低，会导致钙离子大量内流，进一步促使活性氧自由基产生[11]，这种状态会导致线粒体膜通透性转换孔道持续开放，使线粒体膜电位丧失，释放细胞色素C并与凋亡蛋白酶活化因子-1相结合形成多聚体，促使Caspase-9与其结合成为凋亡小体，发生Caspase蛋白级联反应，最终导致细胞凋亡[12-14]。此外，Bcl-2与Bax的平衡与细胞凋亡密切相关[15]。目前研究认为细胞凋亡在COPD发病过程中有重要作用[16]，但COPD细胞凋亡的特点及其机制尚不十分清楚。

图2 各组大鼠肺组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达情况

COPD在祖国医学中并无专属病名，根据其临床表现、相关症状体征及病情进展状态，大部分医家将其辨病为“咳嗽”“喘证”“肺胀”等。COPD多是由肺部疾病日久迁延不愈所致，故“肺胀”病名与其契合度最高。目前大多医家认为肺胀病因病机在于先有肺虚，之后邪实闭肺而喘,为本虚标实之病，也提示本病的形成和发展不但与正虚相关,而且和外邪的反复侵袭有关，由于外邪入里而产生内外合邪，形成正虚邪恋,最终导致病情加重。此外在COPD发展的不同阶段，病机特点有所侧重，早期以肺虚为主，病情进一步发展,久病累及脾、肾，COPD不断反复的关键内因为肺脾肾虚。故认为本虚标实是COPD的基本病机，本虚多涉及肺脾肾等脏腑，标实多与痰、瘀、六淫外邪等有关。宽胸理肺汤由瓜蒌薤白半夏汤合二陈汤、三拗汤化裁而成，瓜蒌薤白半夏汤可以通阳散结，行气解郁，化痰宽胸，此处用其涤痰行水之功，对于痰湿水饮壅滞于肺脏，肺气失于宣降所导致的咳嗽咳痰、气促有较好的疗效；二陈汤燥湿化痰，三拗汤止咳平喘，联合三子养亲汤共同发挥镇咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。

本实验结果显示，中药各组及乙酰半胱氨酸组血清IL-6、 IL-8、TNF-α、MDA水平及肺组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均显著低于COPD组，血清SOD水平及肺组织中Bcl-2蛋白表达量均显著高于COPD组；HE染色示气道上皮细胞脱落、炎症细胞浸润、杯状细胞增多以及肺气肿形成等现象均有不同程度减轻。提示宽胸理肺汤合三子养亲汤能抑制COPD大鼠血清炎症因子分泌，对抗氧化应激反应，抑制支气管及肺泡上皮细胞凋亡，阻止病情进展。本研究为宽胸理肺汤合三子养亲汤用于临床治疗COPD提供了理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。