二至丸防治类风湿关节炎网络药理学机制探究

刘牧秋，余嘉慧，高安然，陈光星

(1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405;2. 广州中医药大学动物实验中心，广东 广州 510405；3. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)

类风湿关节炎(RA)是以全身关节肿胀、疼痛、僵硬为主要临床表现的慢性自身免疫疾病，往往可导致不可逆的关节损伤、畸形甚至残疾。现代医学治疗RA的常见药物包括非甾体抗炎药、抗风湿药物(DMARDS)和糖皮质激素,然而这些药物伴随诸多不良反应，包括感染、恶心、呕吐、消化道刺激反应、口腔炎症、皮疹、脱发、骨髓抑制和肝脏毒性[1-2]。事实上，RA的中西医结合治疗具有更客观的优势，有更稳定、更显著的疗效，并有效降低了不良反应的概率[3-4]。全国名老中医专家、广东省中医风湿疾病重点专科专病学术带头人、广州中医药大学首席教授陈纪藩教授认为，RA病因病机为肝肾、气血亏虚为本，风寒湿侵袭为标，扶正祛邪是治疗RA的基本原则。加味通痹汤(昆明山海棠、枸杞子、丹参、杜仲、女贞子、墨旱莲)为陈纪藩教授的经验方，治疗上重视益肾养阴，兼顾祛风胜湿，化瘀凉血，在临床应用上已取得了可观的疗效，研究证实可显著缓解活动期RA患者疼痛、肿胀症状，改善C反应蛋白、血沉等炎症指标[5]。二至丸(女贞子、墨旱莲)具有益肾养阴的名方，主治腰膝疼痛、骨蒸潮热、月经量多等。二至丸为加味通痹汤的重要组方，寓有通过滋补肾阴、固本扶正而祛邪外出之意。临床案例证实，单用女贞子一味中药可明显减轻RA患者关节肿痛，降低类风湿因子水平[6]；药理研究表明而二至丸具有抗炎、调节免疫、抗骨质疏松、抗肿瘤等功效[7]，但尚无研究阐明二至丸对防治RA的作用机制。网络药理学是基于生物信息学，阐释中草药“成分-靶点-通路-疾病”网络作用关系的研究方法[8]，取代了药物作用单一靶点的传统研究思路。本研究基于网络药理学技术，深入挖掘二至丸抗RA的作用靶点及通路，并探讨中医证型肾阴虚与RA现代医学发病机制的潜在内涵，为后续基础研究和临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1二至丸活性成分 本研究将关键词“女贞子”“墨旱莲”分别输入TCMSP数据库(中药系统药理学分析平台，http:// tcmspw.com/tcmsp. php)，以口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为筛选条件,挖掘二至丸的活性成分。

1.2二至丸作用靶点 STITCH(http://stitch.embl.de)是检索化合物与蛋白靶点(包括验证靶点及预测靶点)相互作用关系平台。本研究通过STITCH及TCMSP数据库的靶点预测模块，输入二至丸活性成分，得到相应靶点。登录Uniprot 数据库(https:// www.uniprot.org)，限定物种为“Homo sapiens”，校正靶点信息，并将靶点进行基因名与蛋白名的转换。

1.3二至丸抗RA靶点 TTD(https://db. idrblab. org /ttd)是提供药物、靶点、靶向疾病及对应通路关系的数据库。DisGeNET (https:// www.disgenet.org)是整合疾病与基因关联信息的综合性数据库。OMIM (https:// www.omim. org)是在线孟德尔人类遗传数据库，提供所有遗传疾病基因信息。本研究以“rheumatoid arthritis”为关键词，通过TTD、DisGeNET、OMIM数据库获取RA相关基因。整合二至丸作用靶点及RA相关基因，取二者交集，得到二至丸治疗RA的靶点数据。

1.4PPI网络构建 STRING是阐明功能蛋白相互作用关系平台。PPI网络(蛋白相互作用网络，protein-protein interaction network)揭示靶点之间关系，有助于从分子角度阐明机体生理病理机制。在STRING中输入二至丸抗RA靶点,作用阈值设置为0.900(最高)，结合Cytoscape 3.2.1构建可视化PPI网络，网络中“节点”表示靶点，“边”表示作用关系。以网络拓扑分析的度中心性(degree centrality,DC)、介数中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)为参数衡量网络中节点的重要性和关键程度，通过Cytoscape的“network analysis”功能，以DC、BC、CC大于中位数为条件，筛选出hub节点(为网络中的重要节点)。选取hub节点再次构建PPI网络。

1.5靶点-成分互作网络 从上述1.3数据中挖掘关键靶点所关联的成分及其相互作用关系。用Cytoscape 3.2.1软件建立关键靶点与关联成分相互作用关系网络，并计算节点DC值。节点DC越大，与其他节点互作关系越多。

1.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 David 6.8(https://david.ncifcrf. gov/tools. jsp)是为基因或蛋白提供生物功能注释信息的在线工具。在David 6.8中导入二至丸治疗RA靶点，设置FDR(false discovery rate,错误发现率)<0.01，进行GO(gene oncology,基因本体)富集分析，以阐释基因的共同生物功能，包括了分子功能、生物学过程、细胞组件3个模块。同时利用David 6.8进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,基因组百科全书数据库)信号通路富集分析，设置FDR<0.05，结合文献挖掘筛选与RA相关的信号通路，记录通路所富集的基因及P值(false positive rate,假阳性率)，并用R软件绘制气泡图。

1.7分子对接 采用Autodock 4.0软件对二至丸和核心活性成分和抗RA的关键靶点进行分子对接分析。Autodock是一种分子模拟的自动化程序，使分子之间通过几何匹配和能量匹配相互识别，从而预测配体和蛋白靶标之间相互作用关系[9]。在PDB数据库(https://www.rcsb.org)中下载关键靶点蛋白结构的pdb格式文件，运用pymol软件对蛋白进行修饰，移除配体、水分子。在ZINC数据库(http://zinc.docking.org)下载活性成分2D结构式的mol2文件。运用Autodock 4.0软件将pdb和mol2文件转化为pdbqt格式文件后，进行分子对接并计算结合能，结合能越小则配体与受体亲和力强，所需能量越少。结合能小于0说明受体和配体之间可自发结合。

2 结 果

2.1二至丸活性成分筛选 我们在TCMSP数据库中检索出女贞子119种成分，墨旱莲48种成分，基于OB、DL筛选及删除重复后有21个活性成分纳入研究，见表1。

2.2二至丸治疗RA活性成分靶点 在STITCH、TCMSP数据库挖掘二至丸活性成分对应的131个靶点。在DisGeNET、TTD、OMIM数据库得到RA相关基因1 908个。取交集后筛选出75个二至丸治疗RA的靶点。

2.3PPI网络构建 本研究利用75个靶点绘制PPI网络图(图1A)，计算网络拓扑分析3个参数的中位数后，设置DC≥32，BC≥0.005，CC≥0.418，得到25个Hub节点，为二至丸治疗RA的关键靶点，关键靶点信息见表2。利用此25个hub节点再次建立PPI网络图(图1B)。其中TP53、MAPK1、JUN、SRC的度中心性值较高(DC≥21)，在介导RA生物过程中起到重要作用。

表1 二至丸21个活性成分基本信息

A：75个二至丸抗RA靶点互作关系；B:25个关键靶点互作关系图1 PPI网络图

2.4成分-关键靶点互作网络构建 本研究发现25个关键靶点与12个二至丸活性成分具有相互作用关系，成分-关键靶点互作网络见图2。我们认为此12个成分为二至丸抗RA的核心活性成分，见表3。二至丸中槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等活性成分关联多个关键靶点(DC≥6)，在治疗RA药理机制中起到重要作用。

2.5GO富集分析 本研究对75个二至丸治疗RA的靶点进行GO富集分析，得到46条GO途径满足FDR<0.01，绝大多数属于生物学过程模块，按照P值从小到大对GO途径进行排列，筛选出属于生物学过程模块的前15条GO途径，包括了 RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、转录的正调控，DNA模板、细胞对缺氧的反应、凋亡过程的负调控、对药物的反应、细胞对脂多糖的反应、基因表达的正调控、老化、一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应、对脂多糖的反应、血管生成、对缺氧的反应、细胞老化、序列特异性DNA结合转录因子活性的调控(见图3A)。如图所示，横坐标表示P值，纵坐标表示各项生物学过程。综上，二至丸防治RA的生物过程主要与增殖、凋亡、炎症反应、血管生成相关。

表2 二至丸抗RA的21个关键靶点基本信息

图2 成分-关键靶点网络图

表3 成分-关键靶点网络图中12个核心活性成分基本信息

2.6KEGG信号通路富集分析 KEGG富集分析后得到13条与RA相关的信号通路，见图3B及表4。图中表明，二至丸抗RA作用机制主要通过介导TNF信号通路、HIF-1信号通路等。

2.7分子对接结果 本研究将活性成分槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚与靶点TP53、MAPK1、JUN、SRC进行分子对接，见表5。结果提示结合能均小于0，配体槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚与受体TP53、MAPK1、JUN、SRC可自发结合并相互作用。

图3 GO估计分析柱状图及KEGG信号通路富集分析气泡图

表4 二至丸治疗RA相关13条信号通路具体信息

3 讨 论

RA是累及全身多关节、多脏器的慢性炎症性自身免疫性疾病，其发病机制非常复杂，主要与关节滑膜炎症及骨质破坏相关[10]。其中RA发病的重要环节为滑膜成纤维细胞(RA-FLS)的异常增殖，产生大量促炎细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)等，导致局部炎症，损伤关节软骨[11]。

表5 分子对接结果

加味通痹汤是名老中医陈纪藩教授治疗RA的验方，而二至丸是其重要组成部分，通过补肾阴、扶正气而除风湿外邪。本研究通过网络药理学技术，发现二至丸抗RA的核心活性成分为槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，关键靶点为TP53、MAPK1、JUN、SRC等。这些关键靶点参与多条通路的信号转导，其中TP53(肿瘤抑制基因p53)与RA-FLS凋亡相关，而RA滑膜组织中TP53基因突变增多而功能缺失，抑制了RA-FLS的正常凋亡[12]。MAPK1组成MAPK通路中的关键分子细胞外信号调节激酶(ERK),调控有丝分裂及减数分裂，促进细胞增殖[13]。JUN组成转录因子AP-1，介导RA炎症因子及MMPs的产生[14]。此外，SRC表达酪氨酸激酶，与RA炎症反应相关[15]。

滑膜炎致软骨损伤是RA发病的关键。RA-FLS所产生的促炎细胞因子刺激滑膜细胞和软骨细胞产生MMPs，造成RA软骨降解[16],同样RA-FLS具有肿瘤样般异常增殖和迁移的特性，对软骨造成侵蚀[17]。TNF信号通路是二至丸介导的最重要的信号通路。肿瘤坏死因子(TNF)为此通路的激活剂，TNF有2个受体(TNFR1和TNFR2)。TNFR1信号传导下游的MAPK通路、NF-κB通路、细胞凋亡通路，TNFR2信号传导下游的JNK通路及Akt依赖的NF-κB通路，达到多水平的促炎效果[18]。MAPK通路激活同样促进炎症因子表达，也与RA-FLS增殖、侵袭和迁移相关[19-20]。研究证实木犀草素、槲皮素、β-谷固醇、山奈酚可通过介导MAPK通路抑制RA-FLS异常增殖和侵袭，显著下调MMPs水平[21-24]。

二至丸介导的HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、催乳素信号通路、Toll样受体信号通路、Foxo信号通路等亦与抗滑膜炎症、抑制损伤密切相关。HIF-1信号通路可通过激活转录因子HIF-1α，上调VEGF的表达，有助于RA滑膜新生血管翳形成[25]，而滑膜血管翳形成是致RA软骨损伤的重要病理基础。T细胞受体信号通路诱导T细胞的增殖并分化成效应T细胞，参与自身免疫性疾病的发生发展[26]。Toll样受体途径中Toll样受体-3(TLR-3)在RA中高表达，参与了炎性因子如IL-6、IFN-β及MMP3的分泌[27]。在Foxo信号通路可控制RA-FLS受氧化应激的影响，避免RA-FLS异常增殖[28]。处于哺乳期的RA妇女疾病活动度风险增加，提示RA催乳素之间的关联。研究表明，催乳素(PRL)可由与RA发病相关的巨噬细胞、T细胞和滑膜成纤维细胞产生，催乳素受体(PRLR)在滑膜巨噬细胞、淋巴细胞和滑膜成纤维细胞中表达，PLR与PRLR结合上调炎性细胞因子IL-6，IL-12β，TNF的表达[29]。

RA的骨质破坏来源于破骨细胞的过度增殖及分化，打破了骨代谢的平衡。RANKL(TNF超家族一员)与破骨细胞表面受体RANK结合激活破骨细胞分化通路，激活成熟破骨细胞，加速骨吸收进程[30]。而研究表明槲皮素具有抑制RANKL表达、抗破骨细胞分化作用[31]。此外对IL-6的应答是造成RANKL的过表达的因素，并且促炎因子TNF-α、IL-17、IL-1β刺激IL-6的分泌[30]，因此抗炎为抑制RA骨质破坏途径。RA女性的发病率是男性的3倍，围绝经期为女性RA发病的高峰期，表明了雌激素与RA发病的关联。在雌激素信号通路中，雌激素可抑制巨噬细胞和T细胞分泌促炎因子IL-1和TNF-α来控制破骨细胞分化进程，雌激素亦可通过诱导调节性T细胞(Treg细胞)的增殖和成熟，来抑制破骨细胞的发育，雌激素替代疗法对预防RA妇女绝经后骨质疏松具有积极作用[32]。综上，二至丸可通过抗炎，激活雌激素信号通路，抑制破骨细胞分化信号通路而抗RA骨质破坏进程。

另一方面，二至丸为滋补肾阴的著名方剂，能有效减轻围绝经期妇女月经紊乱、潮热等症状，曾有国内研究报道肾虚与雌激素减少具有正相关性[33]。我们认为，补肾阴中药或可通过雌激素信号通路，控制围绝经期女性RA进展，雌激素信号通路被抑制可能为肾阴虚介导RA合并骨质疏松的重要机制之一。

本研究基于网络药理学方法，推断二至丸作为著名的滋肾阴方，主要药理成分为槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，通过TP53、MAPK1、JUN、SRC等关键靶点，介导多条通路抑制RA-FLS的增殖和侵蚀软骨，抑制RA-FLS分泌炎性细胞因子、MMPs，并且阻断破骨细胞的分化途径来控制骨质破坏进程，达到防治RA的目的。此外本研究亦创新性地发现，雌激素信号通路被抑制可能为肾阴虚型RA发病与进展的机制之一。以上结论有待进一步临床及实验研究验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。