黄连-肉桂对db/db小鼠肠道菌群及内毒素影响的研究

穆国华，赵宗江，蒋 里，赵进喜

(1. 北京中医药大学东直门医院,北京 100700；2. 北京中医药大学，北京 100029)

2010年我国疾病预防控制中心(CDC)联合中华医学会内分泌学分会对我国18岁及以上人群的糖尿病的患病情况进行了调查，结果显示糖尿病患病率高达9.7%[1]，而到2013年时，我国慢性病及其危险因素监测显示，我国18岁及以上人群糖尿病患病率已上升至10.4%[2]。2型糖尿病以高血糖、胰岛素调控葡萄糖代谢能力下降(胰岛素抵抗)、胰岛β细胞功能缺陷而引起的胰岛素分泌减少或相对减少为主要特点，预防或延缓2型糖尿病的发生发展受到国内外医学工作者的重视。中医药对2型糖尿病的防治有一定的优势，黄连、肉桂为交泰丸的组成药物，交泰丸可以有效改善糖尿病的高血糖状态及胰岛细胞功能，延缓糖尿病的并发症发病进程[3-5]，但作用机制尚不明确。近几年的研究发现，肠道菌群紊乱是2型糖尿病发生发展的一个重要影响因素，调节肠道菌群可以有效调控血糖[6-7]。实验研究显示，肠道菌群紊乱可能与内毒素血症的介导有关，两者相互影响，最终引起肥胖和2型糖尿病的发生[8]。内毒素是革兰阴性菌细胞壁的主要结构成分，其最主要的成分是脂多糖(LPS)。故本实验以db/db小鼠为研究对象，通过检测肠道菌群及LPS含量，探讨了黄连、肉桂降低血糖的机制，旨在为黄连、肉桂更好地治疗2型糖尿病提供实验数据支持。

1 实验材料与方法

1.1动物 6周龄SPF级雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠(C57BLKS)30只以及同周龄雄性同窝野生型db/m小鼠6只，均购自常州卡文思实验动物有限公司，合格证号：SCXK(苏2016-0010)，db/m小鼠体重20～25 g,db/db小鼠体重35～40 g，于中国中医科学院中医基础理论研究所SPF级动物房饲养，室温(22±2)℃，湿度(50±10)%，每天光照12 h，自由饮水、进食(标准饲料)。本实验方案得到中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会批准(20190710)。

1.2药物及试剂 二甲双胍片(商品名：格华止，中美上海施贵制药有限公司，规格：0.5 g×20片)。黄连及肉桂购自北京康美制药有限公司，由北京中医药大学科研实验中心进行含量测定，并制成浸膏，均符合2010版《中国药典》合格标准。

1.3仪器 稳豪型血糖试纸，产品标准证号：YZB/USA 0659-2010,强生(上海)医疗器材有限公司；1.8 mL外旋冻存管，购自corning公司；50 mL离心管，购自corning公司；磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(DP712)，购自TIANGEN公司；强生稳豪型血糖仪(ONETOUCH UltraEasy),强生(上海)医疗器材有限公司；体重仪(中科生命科技股份有限公司)；台式高速冷冻离心机，安徽中科中佳，型号：KDC-140HR；DNA抽提试剂盒，DNeasy®PowerSoil®Pro KitQIAGEN美国；测序试剂盒，MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent KitsIllumina；气质联用仪，安捷伦公司(Agilent Technologies Inc.CA,UAS)的8890B-5977B GC/MSD。

1.4实验方法 所有小鼠按3只/笼饲养于独立通气笼系统内，室温(24±2)℃，12 h光照维持，昼夜循环，自由摄食、饮水。普通饲料适应性喂养1周后，测量db/db小鼠尾尖静脉血糖，选取3次空腹血糖>13 mmol/L(禁食6 h，间隔1 d)的db/db小鼠30只，随机分为模型组、二甲双胍组、黄连组、肉桂组、肉桂-黄连组，每组6只，6只同龄的db/m小鼠作为正常组。正常组和模型组给予生理盐水灌胃，各药物组给予相应药物灌胃，均1次/d，连续8周。其中二甲双胍成人剂量为1 500 mg/60 kg，黄连∶肉桂=10∶1，小鼠给药剂量按照人和动物间体表面积进行换算：小鼠剂量(mg/kg)=9.1×人的临床剂量(mg/kg)。

1.5观察指标及方法

1.5.1一般情况及体重和血糖水平 实验过程中观察各组小鼠的体表特征及行为学变化；分别于灌胃前(0周)及灌胃后每周测量各组小鼠体重，计算各组小鼠体重的平均值，绘制各组小鼠体重变化的趋势图；分别于灌胃前(0周)及灌胃4周、8周后，禁食6 h后尾静脉取血，采用血糖仪测定各组小鼠血糖。

1.5.2肠道菌群基因测序

1.5.2.1样品配置 灌胃8周后，采用提尾反射法收集小鼠粪便标本，未排便的小鼠，以无菌棉签按揉小鼠腹部，刺激小鼠排便，使用无菌EP管收集标本，每管采集3粒粪便，标记后放入-80 ℃低温冰箱保存。

1.5.2.216S-rDNA提取 添加0.5 g样品、978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer到Lysing Matrix E tube；MP研磨仪中震荡40 s，速度6 m/s；14 000 r/min离心10 min，转移上清至1.5 mL离心管中，加入250 μL PPS，混匀；室温14 000 r/min离心5 min，转移上清至已加入900 μL Binding Matrix的2 mL管中，混匀，上下颠倒3 min；瞬离5 s(即转速刚升上去便停止)，小心倒弃上清；加入500 μL 5.5 mol/L的异硫氰酸胍溶液，混匀，转移到SPINTM Filter中；加入500 μL SEWS-M，14 000 r/min离心1 min，弃滤液，再重复洗涤1次；弃去收集管中液体，14 000 r/min离心3 min，去除残留溶液，晾干3 min；加入100 μL 55 ℃预热的DES洗脱液，静置5 min；室温14 000 r/min离心2 min，弃去SPINTM Filter，得到总DNA。

1.5.2.316S-rDNA检测 DNA纯度和浓度检测：NanoDrop 2000；DNA完整性检测方法：1%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，时间为20 min；PCR扩增：将PCR产物采用QuantusTMFluorometer进行定量检测，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。构建PE文库及Illumina测序，Miseq文库构建，利用Illumina公司生产的Miseq PE300平台进行测序。

1.5.2.4菌群分析 在门(Phylum)分类水平下进行物种分析；通过样本层级聚类分析、PCA分析(主成分分析)、PCoA分析(主坐标分析)进行组间Beta多样性分析，对不同组别的微生物群落间的物种多样性进行组间比较，以分析不同分组间群落组成的相似性以及差异性，选择Bray-Curtis距离算法对样本间菌群的丰度分布差异程度进行量化分析，获得距离矩阵，制作样本距离Heatmap图。

1.5.3血清LPS含量 灌胃8周后，各组小鼠去眼球采血,分离血浆、血清置EP管内,存于-80 ℃冰箱,样本集齐后统一处理。采用酶联免疫法检测血清中LPS含量。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况及体重比较 正常组小鼠毛色光亮，行动敏捷，体型瘦长，活动频繁。各药物组小鼠形体肥胖，动作迟缓，活动少，摄食及饮水增多，灌胃后期模型组小鼠出现竖毛，体温偏低，对外界刺激反应迟钝的现象。所有db/db小鼠在开始实验时体重为40 g左右，db/m小鼠体重在23 g左右；灌胃后与模型组及二甲双胍组比较，黄连组、肉桂组及黄连-肉桂组小鼠体重增长趋势减缓，黄连-肉桂组体重增长减缓最明显。见图1。

图1 各组小鼠灌胃前及灌胃后各周体重变化趋势

2.2各组小鼠血糖比较 灌胃前，各组db/db小鼠血糖比较差异无统计学意义(P均>0.05)；灌胃期间正常组、模型组小鼠血糖相对平稳，各药物组小鼠血糖呈明显下降趋势，其中黄连-肉桂组小鼠血糖下降趋势最为明显，见图2；灌胃8周后，模型组小鼠血糖明显高于其他组(P均<0.05)；黄连组与黄连-肉桂组小鼠血糖均明显低于二甲双胍组和肉桂组(P均<0.05)，肉桂组与二甲双胍组比较、黄连组与黄连-肉桂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

图2 各组小鼠灌胃前及灌胃4周、8周血糖变化趋势

2.3各组小鼠肠道菌群多样性比较

2.3.1物种分析 与正常组比较，模型组及二甲双胍组小鼠粪便中后壁杆菌门(Firmicutes)丰度增加，拟杆菌门(Bacteroides)丰度下降。与模型组及二甲双胍组比较，黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组小鼠粪便中后壁杆菌门丰度明显下降，其中黄连-肉桂组下降最明显；黄连-肉桂组拟杆菌门丰度、肉桂组及黄连-肉桂组放线菌门(Actinobacteria)丰度及黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组变形杆菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)丰度明显增加。见图3。

表1 各组小鼠灌胃前及灌胃4周、8周血糖水平比较

图3 各组小鼠肠道菌群门(Phylum)分类水平下物种组成分类

2.3.2Beta多样性分析 正常组与模型组之间物品组成丰度差异明显；二甲双胍组与模型组物种组成丰度相似；黄连组、肉桂组间枝长最短，物种组成丰度相似，其次是与正常组分度相似；黄连-肉桂组与其余组物种组成丰度差异较大。见图4。

2.4各组小鼠血清LPS含量比较 正常组、模型组、二甲双胍组、黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组小鼠LPS含量分别为(0.011±0.011)EU/mL、(0.025±0.016)EU/mL、(0.010±0.005)EU/mL、(0.008±0.005)EU/mL、(0.010±0.002)EU/mL、(0.006±0.004)EU/mL，模型组小鼠血清LPS含量明显高于正常组(P<0.05)，各药物组均明显低于模型组(P均<0.05)，各药物组间比较差异差异均无统计学意义(P均>0.05)，但黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组均有低于二甲双胍组的趋势，且黄连-肉桂组最低，其次为黄连组，最后是肉桂组。

3 讨 论

黄连、肉桂是交泰丸的组成药物，早期用来治疗由心肾不交而引起的失眠，最早见于明韩懋所著的《韩氏医通》：“黄连生用为君，佐官桂少许，煎百沸，入蜜，空心服，能使心肾交于顷刻。”2型糖尿病属于中医“消渴病”的范畴，明何柏斋《医学管见》提出消渴病的病机为：“造化之机，水火而已……交则为既济，不交则为未济。消渴证，不交而火偏盛也。”此理论为黄连、肉桂治疗2型糖尿病提供了有力的理论基础。黄连主要成分是小檗碱，小檗碱是公认的腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)激活剂，可有效治疗2 型糖尿病[9]。肉桂的主要成分为桂皮醛和肉桂酸，肉桂酸可促进胰岛β细胞分泌胰岛素[10]。本研究以db/db小鼠为研究对象，分别用目前公认的一线降糖药物二甲双胍和黄连、肉桂以及黄连-肉桂作为干预措施，探讨了黄连、肉桂单用及联用治疗2型糖尿病的机制。

图4 各组小鼠肠道菌群样本距离Heatmap图

近几年，肠道菌群对2型糖尿病发生发展的影响成为研究的热点之一。人类的肠道内寄居者数以千万的微生物，在正常情况下，各类菌群之间可以互相制约，在一定程度上达到一定的生态平衡，与人类形成共生关系，这也是维护人体健康的重要环节，一旦这种平衡被打破，将会导致各种疾病的发生[11]。肠道菌群的结构和功能受到多种因素的影响，如遗传、饮食、免疫、药物等，进而可以通过改变代谢的途径和介导炎症免疫反应等影响人们的糖脂代谢，从而会导致肥胖及2型糖尿病的发生发展[12]。肠道菌群从门的水平上可分为5大类，包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门、放线菌门和梭形杆菌门，其中约90%由厚壁菌门和拟杆菌门构成。拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度和肥胖密切相关，肥胖小鼠具有更多的厚壁菌门，因为厚壁菌门能摄取更多的能量，使体重增加[13-14]。本实验结果显示，各药物组小鼠体重增长趋势均减缓，黄连-肉桂组体重增长减缓最明显；黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组小鼠粪便中后壁杆菌门丰度明显下降，其中黄连-肉桂组下降最明显，提示黄连-肉桂可能通过减少db/db小鼠的后壁杆菌丰度而抑制体重增长，与以上研究结果一致。

LPS被认为是2型糖尿病发生发展的重要因素之一，其是一种重要的炎症刺激物，与肠道菌群相互影响，最终可以导致肥胖及2型糖尿病的发生。Wang等[15]研究发现，高能量饮食可以造成肥胖小鼠肠道内革兰阴性菌大量繁殖，而革兰阴性菌可以破坏肠道黏膜屏障，促使肠壁的通透性增加，大量LPS入血并诱发炎症免疫反应，最终经过一系列的反应诱导胰岛素抵抗的发生[16-17]。Cani等[18]发现，健康的小鼠经过高脂饲料喂养4周后，小鼠血中 LPS 含量逐渐升高，证实高热量饮食改变了小鼠的肠道菌群，进而使内毒素含量增高，两者之间具有紧密联系；接着向小鼠体内连续低量的持续注射LPS，小鼠逐渐出现了肥胖，进一步发展后出现随机血糖增高和胰岛素抵抗。Asghar等[19]研究证实，LPS由革兰阴性菌裂解后释放，通过肠壁进入血循环，可以诱发“代谢性内毒素血症”的发生。LPS入血后，结合LPS结合蛋白，而后与LPS受体CD14一起作用并激活CD14/Toll样受体4，从而激活体内炎症级联反应，最后会导致大量炎性因子释放增加，引发全身慢性非特异性低度炎症反应，这些都可以干扰胰岛素信号的转导，诱导胰岛素抵抗的发生。本实验结果显示，各药物组小鼠血糖和血清LPS含量均明显降低，且黄连组和黄连-肉桂组小鼠血糖均明显低于二甲双胍组和肉桂组；各药物组间血清LPS含量比较虽然差异无统计学意义，但以黄连-肉桂组最低。提示黄连-肉桂可更有效降低血糖，减少LPS释放。

综上所述，黄连-肉桂可以有效降低db/db小鼠血糖，减缓体重增长，可能与其可以有效调节小鼠肠道菌群及减少LPS的释放有关。本实验为黄连-肉桂在2型糖尿病的临床应用中提供了一定数据支持。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。