双水相萃取黄浆水酯化液中的酯类风味物质

李亚男，杨铭，陈正行*，罗小虎，万盈

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 (江南大学)，江苏 无锡，214122)2(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

黄浆水是白酒固态发酵过程中，沉积在窖池底部的棕黄色黏稠液体，含有酒精、水分及各种香味物质等[1-2]。将黄浆水酯化用于白酒勾兑，不仅能弥补白酒风味成分的不足，还能避免人工添加香精产生的“浮香”问题[3-4]。但黄浆水酯化液中水的含量在90%以上，如何提取酯类物质是应用的关键。目前常见的提取方法有蒸馏[5]和超临界CO2流体萃取[6]，该现有方法均存在设备投入大，萃取成本高[7-8]，无法满足实际生产应用的问题。

双水相体系如乙醇/异丙醇/丙酮等亲水有机溶剂和水的混溶体系在(NH4)2SO4、Na2CO3、K2HPO4、NaH2PO4、K3PO4等无机盐的作用下出现分层以达到分离作用。PRATIWI等[9]利用乙醇/硫酸铵体系萃取琥珀酸；XU等[10]利用1,4-二恶烷/Na2SO4体系萃取乳酸；姚誉阳等[11]采用PEG-NaH2PO4体系萃取头孢呋辛酯。双水相萃取具有较高的生物相溶性、易于放大、可连续化操作，已经应用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素以及色素等产品的分离和纯化，必将在生物工程、食品等领域广泛应用[12-14]。

本文采用双水相萃取分离提取洋河酒厂黄浆水酯化液中的酯类，利用酯化液中本身含有的乙醇进行成相，研究确定最合适的萃取用盐，优化双水相的萃取工艺。范文来等[15]研究表明，绵柔型白酒的关键风味酯类有己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸乙酯，并考察了该5种风味酯类在双水相体系中的分配系数和萃取率。对萃取液进一步处理得到调味液粗产品，与黄浆水的理化性质和天之蓝白酒的风味成分对比，考察双水相萃取酯类的效果。基于该研究为黄浆水酯化液的高效利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄浆水，江苏洋河酒厂；黄浆水酯化液，酯化制备；NaH2PO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、无水乙醇(均为分析纯)，己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸乙酯(均为色谱纯)，国药沃凯化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2020气质联用仪(搭配HS-10自动顶空进样器)、SH-Rtx-Wax毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本SHIMADZU公司。

1.3 风味酯类分析方法

样品前处理[3]：用去离子水将样品稀释10倍，取8 mL加入20 mL顶空瓶中，加入3 g NaCl，振荡使水溶液过饱和，压紧瓶盖。

顶空-GC-MS定性分析[16-17]：以SH-Rtx-Wax毛细管色谱柱对样品进行分离。GC升温程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速度升温至90 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持7 min；进样口温度250 ℃，载气He，流速2 mL/min，进样量1 μL，不分流进样；MS条件：EI，电离能量70 eV，灯丝电流设定值 120 μA；离子源温度200 ℃，扫描方式：SIM。

顶空-气相法定量分析：DB-Wax毛细管色谱柱对样品进行分离，检测器为FID氢火焰离子检测器，外标法定量。自动顶空进样器程序：恒温炉60 ℃，样品流路温度100 ℃，传输线温度100 ℃，GC循环35 min。

1.4 无机盐/乙醇双水相平衡相图的绘制

采用浊点滴定法[18]：取50 mL具塞刻度试管若干，加入10 mL去离子水；准确称取不同质量的无机盐分别加入试管中，涡旋使之充分溶解，形成不同质量分数的无机盐-水溶液；将无水乙醇注入酸式滴定管，对无机盐-水溶液进行滴定，以气泡消失溶液恰好变为乳浊液为滴定终点，记下无机盐的质量m以及对应的乙醇消耗量V。以无机盐质量分数为横坐标轴，浊点乙醇体积分数为纵坐标轴，绘制平衡相图。

1.5 双水相体系中相比、分配系数和萃取率的测定

结合参考文献[18-19]，改进试验方法和计算公式，准确称取不同质量的无机盐(精确到0.000 1 g)，置于20 mL具塞刻度试管中；加入黄浆水酯化液15 g，使每只试管的总体积约为15 mL，形成不同盐浓度梯度(根据相图，盐浓度高于最低加盐量)的萃取体系；涡旋振荡5～10 min使无机盐充分溶解并与酯化液充分混合，静置过夜；待分层充分稳定后，分别读取上下相的体积，计算相比R；分别吸取上下相0.8 mL，稀释10倍，对5种主要风味酯类(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸乙酯)的浓度进行定量分析，相比R、各酯类分配系数K、萃取率Y计算如公式(1)～公式(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：Vt、Vb，分别为上下相的体积，mL；Ct、Cb，分别为酯化物在上相和下相中的质量浓度，mg/L。

1.6 萃取液进一步脱水除杂

用分液漏斗分离萃取后得到上相液体，缓慢添加无水Na2SO4粉末直至不再产生絮状沉淀，再加少量无水Na2SO4，振荡后静置过夜；离心弃去沉淀，硅藻土过滤后即为调味液粗产品(简称调味液)，测定调味液的理化指标和风味成分。

2 结果与分析

2.1 双水相体系的选取

根据预实验选取成相较好的4种无机盐K2HPO4、NaH2PO4、Na2CO3、(NH4)2SO4，分别绘制与乙醇的相平衡关系相图，如图1所示。实线以上是两相区，以下是均相区；图中虚线是相图的连接线，上相T主要含乙醇，下相B主要含无机盐。点M表示体系分相后，上相体积与线段TM的乘积等于下相体积与线段MB的乘积。当乙醇含量一定时，无机盐的含量越高，相比R(即MB/TM)越小，上相所含乙醇越多无机盐越少，下相则相反。当连接线越偏离曲线时，上下相组分差异越大，则有更好的分离效果；当平衡曲线的曲率越大，偏离连结线的程度越深，分相越快越明显。K2HPO4的平衡曲线弯曲程度最深，Na2CO3次之，(NH4)2SO4的平衡曲线最接近连接线。另外，K2HPO4的溶解度较大(20 ℃，62 g/100g水)，可控范围较广，20 ℃左右溶解性平稳，双水相体系受温度的影响较小。Na2CO3在20～30 ℃溶解度相差20 g左右。因此，选用分相能力最强、性质较稳定的K2HPO4作为双水相萃取的分相用盐，这与范蕊庆等[20]和ZHANG等[12]选取的萃取盐相同。

2.2 双水相萃取酯化液中风味酯类的工艺优化

2.2.1 K2HPO4浓度对双水相萃取酯类的影响

酯化液的乙醇体积分数为20%左右，加入不同质量分数的K2HPO4，考察K2HPO4浓度对相比R、分配系数K和萃取率Y的影响。由图2可知，随着K2HPO4质量分数的增大，相比R急速下降后趋于平缓，5种酯类物质的分配系数K随之增大，萃取率Y呈先上升后下降的趋势，在无机盐质量分数为80%左右时达到最大值，5种酯类的萃取率均达到90%～99%。当K2HPO4的浓度较低时，与乙醇争夺水分子的能力较弱，使得大量的水分聚集在上层，上下相组分差异较小，极性相差不大，对酯类选择性不强，分配系数相对较低；随着K2HPO4浓度升高，盐析效应和结合水能力增强，K2HPO4夺走了酯类周围的水分子而将酯类排挤出水相(盐相)而进入上相(乙醇相)，相比R下降，上下相组分差异增大，对酯类的选择性增强，分配系数K也显著增大[8]。

不同酯类K值的大小关系为：辛酸乙酯>己酸乙酯>戊酸乙酯>丁酸乙酯>乙酸乙酯，这与它们的极性呈负相关，溶剂的极性代表疏水力的强弱，极性越强越易溶于水，而极性越弱则较为难溶而易于分层。一般情况下，可以用介电常数来度量溶剂相对极性的强弱，结合表1中5种酯类化合物的介电常数和溶解性[21]，验证了双水相体系对酯类的分离效果取决于其疏水作用的强弱。

a-K2HPO4/乙醇；b-(NH4)2SO4/乙醇；c-Na2CO3/乙醇；d-NaH2PO4/乙醇图1 无机盐/乙醇双水相体系相图Fig.1 Phase diagram of inorganic salt/ethanol aqueous system

a-相比R；b-分配系数K；c-萃取率Y图2 K2HPO4质量分数对双水相体系相比R、分配系数K和萃取率Y的影响Fig.2 Effect of the K2HPO4 mass fraction on the phase ratio R, the partition coefficient K and the extraction rate Y in aqueous two-phase system

表1 五种酯类化合物的相对介电常数和溶解性Table 1 Relative permittivity and solubility of five ester compounds

2.2.2 pH对双水相萃取酯类的影响

酯化液含有未被酯化的有机酸，其pH值在4.5左右，调节pH值至3.5、4.5、6.0、7.5、8.5、9.5、10.5，加入质量分数为80%的K2HPO4，考察不同pH对相比R和己酸乙酯的分配系数K的影响，如图3所示。pH对相比R和己酸乙酯分配系数K无显著影响。古博华[19]研究表明硫酸铵/丙酮双水相体系萃取丁二酸中，萃取率随pH值增大而减小，可能缘于pH值的增大使越来越多的丁二酸生成盐，易溶解于水相(下相)而几乎不溶于丙酮；而本文中H+浓度并不影响酯类在体系中的存在形式，且萃取盐K2HPO4是缓冲盐，酯化液中有机酸含量较低，K2HPO4本身具有稳定pH的性质，因此，选择双水相体系的pH值为4.5。

图3 不同pH对双水相体系的相比R和己酸乙酯的 分配系数K的影响Fig.3 Effect of pH on the phase ratio R and the partition coefficient K of ethyl hexanoate in aqueous two-phase system

2.2.3 乙醇含量对双水相萃取酯类的影响

双水相体系中K2HPO4质量分数为80%，酯化液中原乙醇体积分数为20%，考察添加无水乙醇的含量对R、K和Y的影响。如图4所示，随乙醇含量增大，上相的体积也随之增大，相比R增大；K值随乙醇的含量增大而上升，当乙醇添加量达20%后趋势平缓；乙醇含量的增加对酯类的萃取效果有一定影响[18]，除极性较大的乙酸乙酯萃取率从93%提高至99%，4种酯类萃取率均变化不大，为95%～100%。添加乙醇对上相有稀释作用，酯类的浓度随之降低，对萃取率无显著提升的作用，考虑到节省溶剂，避免后续去除溶剂对酯类造成的损失，双水相体系应不添加额外乙醇，以酯化液中乙醇体积分数20%为较优条件。

a-相比R；b-分配系数K；c-萃取率Y图4 乙醇添加量对双水相体系相比R、分配系数K和萃取率Y的影响Fig.4 Effect of ethanol content on the phase ratio R, the partition coefficient K and the extraction rate Y in aqueous two-phase system

综上所述，本文确定了双水相萃取酯化液中风味酯类的较优工艺为：酯化液15 g，K2HPO4质量分数为80%，乙醇体积分数为20%，pH值为4.5，在该条件下，5种酯类的萃取率均达到90%～99%，这与XU等[10]的乳酸萃取率最高达91%和姚誉阳等[11]的头孢呋辛酯萃取率92%的萃取效果接近；该萃取率高于裴莹等[22]的α-酮戊二酸萃取率80.45%和PRATIWI等[9]的琥珀酸萃取率82%，证明了双水相体系对酯化液中的酯类有较好的萃取效果。

2.3 调味液理化性质和风味化合物分析

2.3.1 黄浆水和调味液理化性质分析

黄浆水和调味液的基本理化性质如表2所示，黄浆水酯化、萃取和脱水处理后，水分含量从91.11%降低至1.14%，乙醇含量高达98.96%，萃取效果显著，用该调味液进行勾兑不会降低基酒的酒精度；调味液总酯含量(67.85 g/L)显著高于黄浆水(1.37 g/L)，总酸几乎未检出。此外，在双水相萃取的过程中，残余蛋白、糖类、淀粉、醛类等含有亲水基团被留在下相而去除；单宁及色素等多酚类物质更易溶于醇相而被富集[3]。

表2 黄浆水和调味液的理化性质Table 2 The physical and chemical properties of yellow water and the blending liquid

2.3.2 萃取液、调味液和洋河白酒风味成分的对比

由表3可知，双水相萃取有效地富集了风味酯类、醇类和一些酚类化合物，萃取液和调味液的酯类质量浓度显著高于酯化液，且萃取液中5种酯类的质量浓度是酯化液的3～5倍；另外，萃取液和调味液中有机酸均未检出；部分短链有机酸易溶于水相被除去，另外，成相用盐K2HPO4是弱碱性盐，与有机酸生成的盐易溶于水相而被去除。

将调味液的风味成分(表3)与洋河天之蓝白酒[3]对比，调味液的风味酯类总量明显高于白酒，关键风味酯类丁酸乙酯(105.08 mg/L)、辛酸乙酯(232.97 mg/L)的含量远高于白酒，己酸乙酯(1 350.47 mg/L)、戊酸乙酯(26.83 mg/L)的含量和白酒接近，乙酸乙酯(30.72 mg/L)的含量略低于白酒，这与酯类极性对分配系数影响的结果一致，有机酸几乎未检出，调味液具有较强的菠萝型、水蜜桃型等甜果香气而无腐臭、恶臭等不愉快的气味[15-17]，可以弥补酸化基酒中酯类风味物质的不足，以提高酒的风味。

表3 酯化液、萃取液和调味液风味化合物的质量浓度 单位：mg/L

3 结论

本文采用双水相萃取的方法分离提取酯化液中的风味酯类，选用成相迅速、溶解范围广泛的K2HPO4为萃取用盐，研究发现随着无机盐浓度的升高，酯类的相比显著下降，分配系数先增大后趋于不变，萃取率先增大后减小；分配系数与酯类疏水性有关，极性越强分配系数越小。较优的酯类萃取条件为：K2HPO4质量分数为80%，pH值为4.5，乙醇体积分数为20%，在该萃取条件下，5种酯类的萃取率均达到90%～99%，且萃取液中5种酯类的质量浓度是酯化液的3～5倍。萃取液用无水Na2SO4进一步脱水得到调味液，调味液的酯类含量明显高于黄浆水和市售天之蓝白酒，且不含有机酸，适合酸化基酒的勾兑。另外，在双水相萃取过程中，残余蛋白、糖类、淀粉、醛类等含有亲水基团的物质留在水相而去除，达到了除杂的效果；综上所述，本文首次将新型的双水相应用于黄浆水酯化液中酯类的萃取，为黄浆水的实际应用奠定了理论基础，具有一定的价值。