香辛料提取物复配对风干肠品质和生物胺的影响

郑欧阳，孙钦秀，刘书成，潘燕墨

(广东海洋大学 食品科技学院， 广东 湛江， 524088)

哈尔滨风干肠是哈尔滨独具特色的风干发酵肉制品，由于其独特的风味而深受消费者的喜爱。然而在风干肠的发酵过程中，一些具有脱羧酶活性的微生物可将氨基酸脱羧进而生成生物胺，虽然少量生物胺对人及生物体的一些生物功能是有利的，然而人类一旦摄入过量的生物胺就会引起胺中毒[1]。因此，如何控制风干肠发酵过程中生物胺产生的量是风干肠安全生产的重要难题。肉制品加工中常用的香辛料含有的一些有效成分(如：挥发性油、有机酸等)不仅可以赋予肉制品特有的风味和香气，还可以抑制细菌繁殖[2]。国内外很多学者证明了香辛料提取物具有一定的抑制微生物生长的作用。ZHANG等[3]研究发现向鸡肉中添加迷迭香和丁香提取物可以有效抑制微生物的生长。EVRENDILEK[4]综述了不同植物精油对常见致病菌的抑菌效果。因此，可以将香辛料提取物添加到发酵肉制品中，通过抑制一些生物胺阳性菌的生长从而抑制生物胺的积累。目前生物胺抑制作用研究大多集中在水产品和酒类产品中，且利用微生物法抑制较多，而在畜禽肉制品中利用香辛料提取物来抑制生物胺积累的研究目前还鲜见报道。

因此，本研究将肉桂、丁香和八角醇溶提取物以不同方式组合(肉桂&八角，肉桂&丁香，丁香&八角和肉桂&丁香&八角)复配后添加到哈尔滨风干肠中，研究风干肠发酵过程中2-苯乙胺、腐胺、酪胺色胺、尸胺和组胺含量的变化，同时，检测了发酵过程中风干肠微生物数量、理化品质和感官品质的变化，以期找到一种可以抑制风干肠中生物胺积累并改善其感官品质的发酵方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生物胺标品(2-苯乙胺盐酸盐、组胺二盐酸盐、尸胺、腐胺二盐酸盐、色胺和酪胺)，美国Sigma公司；乙腈，德国Merck公司；盐酸、甲醇、高氯酸、辛烷磺酸钠、乙醇、氢氧化钾、邻苯二甲醛、冰乙酸、β-巯基乙醇、无水乙酸钠、硫代巴比妥酸、三氯甲烷、氢氧化钠、三氯乙酸、亚硝酸钠、葡萄糖，哈尔滨医药化工试剂厂。以上试剂除乙腈和甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 香辛料提取

每种香辛料的提取方法遵循陈璐等[5]的方法稍作修改，将市场上买来的3种香辛料放在风干箱中，在60 ℃条件下烘干24 h，再用打粉机把干燥的3种 香辛料打碎，并将处理后得到的香辛料粉过筛(40目)，接着精确称取香辛料粉末50 g，加入烧杯中，并向其中添加体积分数95%的食用乙醇0.4 L，放置在55 ℃的水浴锅内，使带转子的搅拌机以600 r/min的速度工作12 h，使用布氏漏斗和真空泵，将提取液，抽滤出来，留下的滤渣再浸提抽提1次。将2次 抽提液混合，使用旋转蒸发仪浓缩，浓缩温度55 ℃左右，使用真空冷冻干燥机将浓缩液进行冻干，使用真空冷冻干燥机。取出冻干物，并将其碾成粉末，放置在-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 哈尔滨风干肠的制作

哈尔滨风干肠的做法按照孙钦秀等[6]的做法，取猪臀部瘦肉18 kg，肥膘2 kg，放入筛孔直径1.5 cm的绞肉机中制成肉馅，接着向其中添加食用盐450 g、亚硝酸钠1.8 g、麯酒180 g、葡萄糖900 g、谷氨酸钠54 g、香辛料提取物5.4 g，将混合好的馅料灌入猪小肠中，肠直径控制在2.5～3 cm，每根肠的质量控制在150 g左右。将成品放置在温度为(25±2) ℃的条件下，通风干燥24 h，并控制相对湿度在60%左右。将恒温恒湿箱调节到(25±2) ℃，保持相对湿度为70%～80%，开始发酵，样品每隔3 d进行1次试验。

根据前期试验结果，本试验共灌制了5 组风干肠，把不添加香辛料提取物的试验作为对照组，肉桂&丁香复合提取物(质量比1∶1)，肉桂&八角复合提取物(质量比1∶1)，丁香&八角复合提取物(质量比1∶1)，肉桂&丁香&八角复合提取物(质量比1∶1)，以添加量0.3 g/kg添加进入肠馅中。每隔3 d对样品进行生物胺、物化指标和微生物数量的测定，在最后一天时，取产品进行感官评定。

1.2.3 生物胺的测定

生物胺的检测方法参考SUN等[7]的方法，利用高效液相色谱柱后衍生法，试验使用高效液相色谱仪并联合C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)和荧光检测器。样品的进量为10 μL，保持流动相的流速为1 mL/min，衍生剂的流速保持为0.3 mL/min，柱温控制在40 ℃，衍生池的温度维持在45 ℃，发射波长设置为465 nm，荧光探测器的激发波长设定为330 nm。梯度洗脱步骤为：用体积分数为75%流动相A(0.1 mol/L乙酸钠溶液-10 mol/L辛烷磺酸钠溶液，pH 5.3)洗10 min，接着在20 min时将流动相A的体积分数下降5%，在38 min时使其体积分数降低到0%，洗脱3 min，然后再在42 min时再用体积分数为75%流动相A进行洗脱。

1.2.4 硫代巴比妥酸反应物的测定

依照WANG等[8]做法来测定硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)值，将2.0 g样品切成小块装入容器中，向每支试管中添加3 mL的TBA溶液，接着再分别加入17 mL 三氯乙酸-盐酸溶液，混合均匀后，放入沸水锅中水浴0.5 h，取出后短时间内使温度降至25 ℃，取5 mL处理后产品，向其中加入相同量三氯甲烷，并以3 000 r/min离心10 min，取上清液在532 nm波长下测量OD值。TBARS值是用每千克的样品中所含丙二醛的毫克数来计算，如公式(1)所示：

(1)

式中：A532表示在532 nm下测出的OD值；V代表试验溶液量,mL(此实验为5 mL)；M代表丙二醛分子质量,(g/mol)；ε代表摩尔吸光系数，数值为15 200 L/(mol·cm)；l代表光程,cm；m代表待测肉制品质量,kg。

1.2.5 微生物的测定

微生物的测定是根据WANG等[9]的试验稍作改动，在无菌环境下，取10.0 g去掉脂肪和结缔组织后切碎的风干肠，向其中加入90 mL的生理盐水，然后进行均质2 min。溶液进行10倍梯度稀释，然后进行培养皿涂布。在37 ℃条件下，在营养琼脂固体培养基上使微生物生长48 h后，进行好氧菌的计数；在30 ℃的条件下，在乳酸菌培养基上使其生长48 h后进行乳酸菌数量的统计；在37 ℃的条件下，在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂固体培养基上培养48 h后进行肠杆菌的计数。

1.2.6 感官评价

感官评价的方法依照的SUN等[10]的方法，感官评价由受过培训的10名人员参与，所有参加感官评定人员依照7分制原则进行评分，评分具体指标包括颜色(7 分为颜色红润，有光泽；1 分为颜色暗黑无光泽)、气味(7 分为具有发酵肉制品特有的风味；1 分为风味较差)、滋味(7 分为浓郁的香味；1 分为滋味很差)、酸味(7 分为酸味很重，无法接受；1 分为没有酸味)、口感(7 分为肉质非常硬；1 分为肉嫩)和总体可接受性(7 分为可接受性高；1 分为可接受性低)。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 生物胺含量的变化

如图1所示，随着发酵时间的延长，生物胺中酪胺的含量呈增加趋势(P<0.05)。前3 d的发酵使酪胺在肉中迅速积累，含量明显增加，试验组风干肠中酪胺的含量由第0天的1.36 mg/kg迅速增加到19.63～25.22 mg/kg(P<0.05)。而到了第6～9天，酪胺含量增加得不明显，尤其是对于2种香辛料的复合的试验组，在后期酪胺的增长没有显著差异(P>0.05)，当发酵结束时，风干肠中的酪胺含量达到最高值28.64～36.96 mg/kg，而未添加复合香辛料的对照组风干肠中酪胺含量则是显著高于添加香辛料提取物组(P<0.05)。复合香辛料肉桂&丁香&八角的对于酪胺的生成抑制效果最好，抑制率可以达到22.32%。

人体如果摄入过多的腐胺不但会引起人体的中毒，还会对组胺和酪胺有协同作用，从而一定程度上增加2种物质的毒性[11]。随着发酵时间的延长，所有风干肠中腐胺的含量呈逐渐增加趋势，对照组在发酵第9天时达到51.42 mg/kg，香辛料提取物对腐胺的积累具有不用程度的抑制作用，其中肉桂&八角&丁香组对腐胺的生成抑制效果最好，发酵结束其腐胺含量仅为40.52 mg/kg，抑制率可以达到39.52%。

尸胺是6种生物胺中含量最多的，第0天到第3天的发酵中，因为混入杂菌的风干肠中的杂菌(尤其是其中的尸胺阳性菌)由于有机质丰富大量繁殖，致使尸胺的含量迅速增加，在第6天到第9天，尸胺的增加速度变得缓慢，这可能是因为风干肠中一些有益菌发酵产生酸性物质，这些酸性物质的产生与积累，使得pH降低，抑制了一些生物胺阳性菌的生长。同样，3种香辛料复合组对尸胺的抑制效果要显著高于任意2种香辛料提取物复合的效果(P<0.05)。MAH等[12]的研究也发现红辣椒对发酵凤尾鱼中尸胺的积累有明显的抑制作用。

组胺是常见的生物胺中对人体毒性最强的生物胺，如果食用了含有过量组胺的食物，情况较轻时会产生不同程度的头疼、腹泻[13]。由图1-D看出风干肠中组胺的含量并不是很高，在发酵第6天到第9天分别测量风干肠中含量为22.32～28.97 mg/kg。但由于组胺的中毒剂量较低，因此发酵过程中组胺的积累仍不可忽视。组胺的变化趋势与酪胺和腐胺的相似，肉桂&丁香&八角组对组胺的抑制效果最好，在发酵第9天时，对组胺的抑制率高达34.2%。CAI等[14]研究发现小茴香、绿薄荷和丁香提取物对红鼓鱼片中组胺阳性菌的繁殖有较好的抑制作用，进而降低了其组胺的含量。

2-苯乙胺和色胺含量的变化趋势与尸胺相似，添加香辛料提取物有效抑制了风干肠发酵过程中2-苯乙胺和色胺的积累，其中肉桂&丁香&八角组对2-苯乙胺和色胺的抑制效果最好，至发酵末期，肉桂&丁香&八角组的2-苯乙胺和色胺分别比对照组低21.86%和20.00%。复合香辛料提取物具有抑制生物胺的作用，可能是因为肉桂、丁香和八角提取物的抑菌作用抑制了生物胺阳性菌的生长。SUN等[7]研究表明，复合香辛料提取物中含有的桉树醇和反式肉桂醛，这些物质具有较强的抗菌作用，对许多重要病原体和腐败菌具有一定的抑制作用。

图1 不同复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中6 种生物胺的变化Fig.1 Changes in the amounts of six kind of BAs in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation注：图中不同大写字母(A～D)表示相同处理组不同发酵时间组间差异性显著(P<0.05)，不同小写字母(a～d)表示相同发酵时间 不同处理组间差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 风干肠发酵过程中TBARS的变化

如图2所示，随着发酵时间的延长,添加和未添加香辛料提取物的风干肠中脂肪都发生了氧化(P<0.05)，脂肪部分氧化会有益于发酵风干肠中形成风味物质，但是氧化过度就会产生酸败味或者哈败味等使人反感的味道。VISESSANGUAN等[15]的试验表明，不是所有的脂肪氧化都会产生让人不喜欢的味道，例如在发酵肉制品中适当的脂肪氧化还可以使其具有特殊风味，我们的试验也印证了这一点。添加香辛料提取物的风干肠的TBARS均比未添加香辛料提取物的组别增加得慢(P<0.05)，发酵第9天时，加入3种复合香辛料提取物组的TBARS值最低，比未添加香辛料的组要低28.88%，以上数据说明香辛料提取物中的有效成分能很有效地抑制发酵风干肠中脂肪氧化，特别是肉桂&丁香&八角提取物组，这可能是因为香料提取物富含多酚化合物，具有一定的抗氧化性[7]。发酵第9天，肉桂&丁香&八角提取物组遏制的情况最佳(P<0.05)，至发酵结束时，其TBARS值比对照组低28.88%。

2.3 风干肠发酵过程中微生物的变化

如图3所示，未发酵时，所有组中的好氧细菌，菌数为5.42 lg CFU/g，由于发酵的前3 d风干肠中有机质含量充分，而对于水分活度较大的风干肠，适宜好氧菌生长，使得试验组与对照组的好氧菌大量繁殖。发酵第6天到第9天时，好氧菌的繁殖受到了抑制，风干肠中好氧菌数的降低与酸度的增加，水分活度的减少与肉中有机物质被消耗有关。发酵前3 d，试验组好氧菌数的繁殖速度稍微小于未添加香辛料的组别，这是由于香辛料提取物可以阻止细菌的增殖。发酵第6天到第9天，未添加香辛料提取物的组好氧菌繁殖程度最高，菌数达7.73 lg CFU/g，添加香辛料提取物的组好氧菌的总数和未添加香辛料复合物会有显著降低(P<0.05)。这说明香辛料提取物有很好的阻止细菌滋生的效果，且3种香辛料提取物组抑制能力最佳。CAI等[14]研究表明添加丁香等浸提油可以有助于红鼓鱼片在贮藏过程中嗜常温菌的生长。

图2 不同复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中 TBARS值的变化Fig.2 Changes in TBARS in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation

图3 不同复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中微生物的变化Fig.3 Changes in bacteria counts in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation

发酵第3天，各组中乳酸菌的生长速度很高，最终乳酸菌相比较其他菌种生长更优，乳酸菌的繁殖可以使产品的酸度升高，这不仅有利于延长产品的贮藏时间，而且可以赋予风干肠特殊的风味。发酵的前3 d乳酸菌的繁殖速度很快，发酵后3 d乳酸菌繁殖速度逐渐减慢，这是由于乳酸菌代谢产生了有机酸，酸度过高，细菌繁殖受到了水分活度降低的阻遏作用。发酵的全程，试验组的风干肠中乳酸菌繁殖速度较快(P<0.05)，由于除乳酸菌以外其他菌的繁殖受到了香辛料提取物的阻遏作用，减少了其他菌对营养物质的消耗，使得乳酸菌的繁殖有环境的优势，可是在发酵第9天时，添加与未添加组的差异不显著(P>0.05)，这表明乳酸菌的繁殖受香辛料提取物的影响较小。

赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶的酶活力在肠杆菌中很高，可以脱羧氨基酸形成尸胺和腐胺[16]。试验组中肠杆菌的积累与发酵的时间成负相关。未添加香辛料提取物组中肠杆菌被抑制效果最差(P<0.05)，发酵第9天时，未添加香辛料的组的肠杆菌量最高达到2.06 lg CFU/g，试验组中肠杆菌的繁殖受到了明显的阻遏，且3种香辛料组阻遏情况最佳，抑制率可达47.90%，添加2种香辛料的效果稍微较弱，此结果与生物胺结论相一致。WANG等[17]研究发现向干腌腊肉中添加植物多酚可以有效抑制肠杆菌的繁殖，本研究中可能是由于香辛料提取物富含多酚物质，对肠杆菌的生长具有一定的抑制作用。

2.4 感官评价

发酵第9天后要对产品进行感官评定，感官评定包括色泽、口味、气味、酸度、口感和产品可接受性等方面，感官评定结果如表1所示。就色泽来说，试验组的得分稍微高过于未添加香辛料提取物的组，但是没有显著性差异，并且在各个添加香辛料中的处理组之间无显著性差异(P>0.05)。提取出香辛料的有效成分呈味效果很好，试验组的产品得分较高的两项为滋味和气味，添加了肉桂&丁香&八角提取物打分最高(P<0.05)。酸度这项指标，添加复合香辛料提取物组的分数高于未添加复合香辛料提取物组，这与香辛料可以抑制杂菌的生长有关，使得乳酸菌繁殖量增加，繁殖代谢生成乳酸使酸度升高。在口感方面，评分最低的是未添加香辛料复合提取物组，3种香辛料提取物组被评分最高(P<0.05)，风干肠的口感受到很多因素影响影响，如酸度、水分含量、肉的质量等[18]。产品可接受性方面，未添加香辛料提取物组评分最低，3种香辛料提取物组获得分数。3种香辛料提取物加入后，产品中无特殊异味，感官品质也有所提高。香辛料中的有效物质，其中酚类和萜类有遏制细菌生长、抑制腐败和防止脂肪氧化作用，有助于香味物质生成，可以使食品品质得到提升[19]。

表1 不同复合香辛料提取物发酵后的风干肠感官得分Table 1 Sensory grade of dry sausages added with different compound spice extracts after fermentation

3 结论

复合香辛料的添加使得2-苯乙胺、酪胺、组胺、腐胺、色胺和尸胺的形成得到有效抑制，且3种香辛料提取物组阻遏效果明显优于其他复配组。同时风干肠的脂肪氧化、好氧菌和肠杆菌的繁殖均得到了有效的抑制，复合香辛料提取物的添加能抑制脂肪氧化，同时添加香辛料处理组的感官评定得分较高。综上，向产品中加入肉桂&丁香&八角复合香辛料提取物有利于产品的安全生产和品质的改善。