流体剪切力促进大鼠髁突软骨细胞凋亡的实验研究

谢勉姣， 周 鹏， 段 晶， 马 秦， 王美青

（1. 军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病国际联合研究中心，空军军医大学第三附属医院口腔解剖生理学教研室，2. 颌面外科，陕西 西安 710032；3. 佳木斯大学口腔医学院口腔基础医学教研室，黑龙江 佳木斯 154007）

软骨细胞死亡是骨关节炎主要的细胞学变化之一[1]，因此，软骨细胞对力刺激的生物学响应规律备受关注。 颞下颌关节髁突软骨的主要功能之一是负重，生理性力刺激可促进髁突软骨的正常代谢活动，而异常力刺激则会影响细胞的正常功能，甚至导致细胞死亡[2]。 我们课题组在以往的研究中发现，不同强度的流体剪切力（FFSS）可以导致大鼠髁突软骨细胞出现不同的生物学响应[3-4]。

整合素（Integrin）是重要的细胞表面跨膜受体，其胞内区可以与骨架蛋白相接形成黏着斑，调节其与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的结合，并介导细胞内外力学信号的转导[5]。 肌动蛋白结合蛋白Talin 1 是细胞黏着斑的重要调节因子， 介导着Integrin 与肌动蛋白（F-actin）的相互联系，从而促进细胞的迁移和斑点附着[6]。 当整合素和Talin 1 与Factin 的结合因力刺激等原因而中断，细胞便失去与ECM 的联系， 过表达Bcl-2 家族中凋亡调节蛋白Bim， 释放线粒体双层膜腔内储存的细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）， 活化细胞内源性凋亡通路，激活Caspase-3，从而引发凋亡[7]。

Calpain 的活化可以激发其水解多种活性蛋白，参与细胞骨架重构、信号转导以及细胞凋亡等多种生理活动[8-9]。 细胞内钙稳态的失衡可以激活Calpain，而钙内流是细胞对力刺激的早期响应之一，钙内流增加可通过活化Calpain 亚基钙结合位点， 引起Calpain 的构象改变，促进细胞骨架相关蛋白水解等效应[10]。 本研究拟通过对软骨细胞加载FFSS 引发细胞凋亡，观察细胞内钙离子浓度的变化以及Calpain、Talin 和肌动蛋白在此期间的变化情况， 以论证在FFSS 刺激作用下，软骨细胞凋亡的相关分子机制。

1 材料和方法

1.1 原代髁突软骨细胞培养及剪切力加载

取3 周龄雌性大鼠 （购买于空军军医大学动物中心）10 只，体式显微镜下小心剥离髁突表面的组织，暴露软骨本体部分，分离大鼠髁突软骨细胞，于高糖培养基（HyClone 公司，美国）中剪碎后，1 500 r/min 离心5 min，收集组织，使用5 mL 胰酶（HyClone 公司，美国）于37 ℃消化组织20 min，使用2 mg/mL Ⅱ型胶原酶（Thermo 公司，美国）于37 ℃下消化组织120 min，最终收集1 500 r/min 离心5 min后的沉淀， 使用新制含1%双抗（HyClone 公司，美国），10%胎牛血清（Gibco 公司，美国）高糖培养基重悬培养细胞，每2 天换1 次液。

将获得的原代软骨细胞接种于加力专用载玻片（Flexcell 公司，美国）上，随机分为对照组（即0 h组）、加力0.5 h 组、加力1 h 组、加力2 h 组、加力4 h 组；当细胞生长至90%融合时，使用Flexcell 流体力学加载机以16 dyn/cm2（1 dyn/cm2=0.1 Pa）的剪切力进行不同时长的刺激。

1.2 钙离子含量检测

根据试剂盒（Beyotime 公司，中国）说明，制作钙离子含量标准曲线， 然后使用试剂盒中100 μL 细胞裂解液收集细胞，4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清液；Bradford 法（Beyotime 公司，中国）进行蛋白浓度定量；设2 个重复孔，每个样本取5 μL，使用去离子水补齐至50 μL；每孔加入150 μL 新制检测工作液（检测缓冲液∶显色液=1∶1），室温避光孵育10 min；酶标仪（Eppendorf 公司，德国）检测575 nm 处吸光度值。 根据标准曲线求出每孔中钙离子的含量，根据蛋白浓度换算1 μg 总蛋白细胞中含有的钙离子量。

1.3 Calpain 活性检测

根据试剂盒（BioVision 公司，美国）说明，使用试剂盒中细胞裂解液100 μL 收集细胞，冰浴20 min后10 000×g离心1 min， 取上清液；Bradford 蛋白浓度定量后，取50 μg 总蛋白，使其体积为85 μL；设3 个重复孔，每个样本内加入10 μL 10×反应液和5 μL Calpain 底物；避光37 ℃孵育1 h；使用荧光酶标仪（Perkin Elmer 公司，美国）读取激发波长400 nm、发射波长505 nm 的荧光值。

1.4 细胞荧光染色

用磷酸缓冲盐溶液 （phosphate buffer saline，PBS）清洗细胞2 次后，4%甲醛溶液室温固定细胞10 min；PBS 冲洗3 次， 每次10 min，0.5% Triton X-100 溶液室温下通透细胞5 min；PBS 冲洗3 次，每次10 min，TRITC 标记鬼笔环肽 （Yeasen Biotech公司，中国）工作液覆盖住玻璃板上细胞，室温避光孵育30 min；PBS 冲洗3 次，每次10 min，含4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗荧光淬灭封片剂（赫特生物公司，中国）封片；4 ℃避光保存，共聚焦显微镜（Nikon 公司，德国）下观察细胞。

1.5 蛋白质印迹（Western Blot）

于冰上使用200 μL 裂解液（BioVision 公司，美国）收集各组加载后的细胞，12 000 r/min 转速下离心5 min 后取上清液。 Bradford 法测定蛋白质浓度，取20 μg 总蛋白上样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE） （BioBrad 公司，美国）分离蛋白，半干转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyrinylidene fluoride，PVDF；Millipore 公司，美国）上后置于5%脱脂奶粉-TBST 封闭液中封闭60 min，稀释抗体Talin（1∶2 000）、Integrin β1（1∶5 000）、Bim（1∶2 000）（Abcam 公司，美国），Bcl-2（1∶500）、β-actin（1∶4 000）（Proteintech 公司，美国），Cleaved-Caspase-3（1∶1 000；Affinity 公司，美国）后置于4 ℃过夜孵育PVDF 膜， 次日复温30 min 后TBST 洗膜3 次， 每次10 min，HRP 二抗（Proteintech公司，美国）室温孵育60 min 后TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 发光液（ZETA 公司，美国）显色发光，使用Image Lab 软件半定量分析图像灰度。

1.6 统计学处理

使用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析。 实验独立重复3 次。 所有数据采取均数±标准差（±s）表示。 多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞内Ca2+浓度变化情况

使用钙离子检测试剂盒对细胞中钙离子含量的检测结果表明，16 dyn/cm2的FFSS 刺激0、0.5、1、2和4 h 后，蛋白总量为1 μg 的原代软骨细胞中钙离子的含量依次增加，于1 h 时达到峰值，并一直维持在较高水平（P＜0.001，图1）。

图1 原代软骨细胞在16 dyn/cm2 的FFSS 刺激下，总蛋白含量为1 μg 的细胞中钙离子含量在不同加力时长下的变化情况Figure 1 Stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress, the changes of calcium content at different time points of 1 μg total protein primary chondrocytes

2.2 Calpain 活性变化

使用Calpain 活性检测试剂盒检测发现，与0 h组相比，加载0.5 h 后Calpain 的水解产物荧光强度便明显升高，1 h 时达到高峰， 2 h 后依然维持在较高的活力水平（P＜0.000 1），但4 h 时水解产物的荧光值降至0 h 组水平（P=0.151 8，图2）。

图2 不同时长16 dyn/cm2 的FFSS 刺激下， 每50 μg 总蛋白含量的原代软骨细胞内Calpain 的活性变化Figure 2 Changes of calpain activity of 50 μg total protein primary chondrocytes stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points

2.3 细胞骨架变化

使用鬼笔环肽对细胞骨架进行荧光染色观察，与0 h 组比较，剪切力刺激软骨细胞0.5 h 时，细胞骨架表达量减少得并不明显（P=0.1 147）；而在刺激1、2 和4 h 后， 细胞骨架的表达量随加力时长的增加而逐渐减少（P＜0.001，图3）。

2.4 Western blot 检 测Talin 1、Integrin β1、Bim、Bcl-2、和Cleaved-Caspase-3 的表达变化

Western blot 检测结果显示，Talin 1、Integrin β1和Bcl-2 蛋白的表达水平与0 h 组相比， 逐渐降低（P＜0.01），而Bim 及Cleaved-Caspase-3 的蛋白表达水平与0 h 组相比明显升高（P＜0.000 1，图4）。

图3 不同时长16 dyn/cm2 的流体剪切力刺激下，细胞骨架F-actin 的变化情况Figure 3 The changes of cytoskeleton protein F-actin stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points

图4 Western blot 检测不同时长16 dyn/cm2 的流体剪切力刺激下，Talin 1、Integrin β1、Bcl-2、Bim 以及Cleaved-Caspase3 的蛋白水平表达情况及其灰度值组间比较Figure 4 Comparison of the expression level and its gray-scale value of Talin 1，Integrin β1, Bcl-2, Bim and Cleaved-Caspase-3 proteins stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points observed by Western blot

3 讨论

钙信号是真核细胞中最原始的第二信使，能够调控各种生理、生化过程[11-12]。 我们课题组早期的研究发现，在病理状况下，存在于细胞膜表面的力敏感性半通道蛋白Cx43 会异常活跃[13]，使得钙离子以非选择性方式自由出入细胞， 导致细胞离子失衡，出现细胞死亡[14]。

Calpain 是钙信号的主要效应分子之一，广泛分布于细胞质和亚细胞器中，Calpain 常见的家族成员为Calpain1 和Calpain2， 微摩尔水平的Ca2+浓度即可激活Calpain，而毫摩尔水平的Ca2+才能激活Calpain2[15]；当Calpain 被过量激活时，它将通过作用于凋亡相关的分子蛋白，参与调控细胞凋亡以及骨组织细胞退变的病理过程，造成相应组织器官的功能障碍[16]。 本研究中，FFSS 刺激组细胞内钙离子的含量明显高于不加力的对照组。

当细胞内钙离子浓度升高后，Calpain 的活性将被过度激活。Calpain 的水解底物包括大多数的细胞骨架蛋白，如桩蛋白（Paxillin）、黏着斑蛋白（Vinculin）和踝蛋白（Talin）[17]；细胞骨架为细胞质提供了力学结构， 在机械压力的传导中起到核心作用，它的张力完整性直接影响细胞的形状及功能[18]。 研究的结果表明，加力初期，作为细胞骨架结构，肌动蛋白并未发生明显的变化，1 h 后随着加力时长的推移其含量越来越少，Talin 蛋白的表达水平也呈下降趋势，说明被激活的Calpain 降解骨架蛋白的活动增强。

Talin 是一种黏附分子， 是构成Integrin 和肌动蛋白物理连接的重要成分。Talin 与肌动蛋白相互作用保持黏着斑稳定，Talin 与Integrin 相结合， 诱导Integrin 胞外段亲和力改变，触发Integrin 形成细胞黏附[19]。本文的研究结果表明，在FFSS 刺激下，胞内大量的Talin 蛋白被Calpain 水解， 与其相结合的Integrin 表达水平也明显减少，这可以导致Talin 与Integrin 在胞内膜边缘的黏着斑水解，细胞黏附作用减弱，成为细胞凋亡的重要基础。

Bcl-2 蛋白家族中，Bcl-2 基因是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用， 而Bim 蛋白在Bcl-2 蛋白家族中行使的却是相反的作用——促进凋亡作用，Bcl-2 蛋白的表达量降低， 凋亡相关分子Bim 蛋白高表达， 均利于促进Bax-Bak 复合体于线粒体膜上形成孔道，破坏线粒体外膜的完整性，释放Cyt C，活化细胞内源性凋亡通路，使凋亡执行分子Caspase-3开始工作， 生成大量Caspase-3 执行功能活化形式的Cleaved-Caspase-3[20]。 本文的研究结果表明，FFSS作用下Calpain 的水解作用增强， 使得黏着斑被大量水解，激活细胞内内源性凋亡通路，最终激活凋亡执行分子Caspase-3 而导致细胞凋亡。

本研究中Calpain 活性于加力4 h 时降至与对照组无差异，可能是由于细胞经过长时间异常力刺激后进入凋亡期，细胞合成蛋白的能力受到明显的影响所致。 虽然FFSS 刺激4 h 后Calpain 的活性降低，但凋亡活动一直保持在较高的水平。

综上所述，本研究通过对原代髁突软骨细胞施加不同时长的流体剪切力刺激，使得胞内钙信号持续高度响应，进而活化细胞内Calpain，使其水解功能增强，细胞骨架相关蛋白Talin 被水解，进而引起细胞黏着斑松动，最终导致细胞凋亡。