一株养殖沙塘鳢肠道溶血性苏云金芽孢杆菌的分离鉴定

赵彦华，史杨白，刘国兴，薛晖

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种革兰氏阳性杆菌，属微生物源杀虫剂，以胃毒作用为主[1]。其中苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis, Bti）是一种对蚊幼虫具有毒杀作用的病原微生物，主要作用成分是芽孢形成过程中合成的具有特异杀虫活性的毒素蛋白[2]。它同蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、人畜病原菌炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）、蕈状芽孢杆菌（B.mycoides）、韦氏芽孢杆菌（B.weihenstephanensis）组成芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌组（B.cereus group），它们的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的DNA 同源性[3]。

在沙塘鳢养殖业的快速发展过程中，养殖环境中大量细菌的分布及沙塘鳢种质资源的退化，导致沙塘鳢的病害日趋严重。近年来，在沙塘鳢养殖过程中出现如鳃部及头部溃烂，肠道出血，体表有出血点等病害现象，但目前针对养殖沙塘鳢病害的研究及防控均处于初级阶段，针对养殖过程中的病害死亡原因，无统一定论。现对养殖沙塘鳢内脏细菌进行分离，在肠道内获得一株溶血性苏云金芽孢杆菌，并进行一系列研究，以期为沙塘鳢养殖病害提供防治参考。

1 研究方法

1.1 材料

沙塘鳢取自江苏省淡水水产研究所沙塘鳢养殖基地，鱼体大小约8～11 cm，体质量约为25～30 g。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 取沙塘鳢，用75%酒精消毒体表后，按照无菌操作的方法，用灭菌手术剪剪开其头部及腹部，分别取肝脏及肠道，匀浆后接种于普通营养琼脂平板上。28 ℃恒温培养48 h 后，挑取形态特征一致的优势菌，编号为SCYB2019 并进行分离纯化、保种。

1.2.2 分离菌鉴定 选取典型菌落，分离纯化后进行常规生理生化特征检验，检验参照《常见细菌系统鉴定手册》[4]进行常规生化指标鉴定。生理生化指标采用API/ATB 半自动化细菌分析仪鉴定，将分离纯化的菌落混于生理盐水中，浓度为0.5 mol/L McFarland。吸取菌悬液接种ID32E 测试卡，每孔接种55 μL，置于35 ℃培养箱孵育24 h。取出置于分析仪阅读器上检测反应，得出编码，转化判定结果。

1.2.3 溶血性试验 将菌株SCYB2019 接种于4%绵羊血平板，绵羊血平板购自环凯生物科技有限公司，置于28 ℃恒温培养24 h 后观察其溶血性。

1.2.4 细菌16 S rDNA 的鉴定 将分离纯化后菌株SCYB2019，用细菌通用引物扩增于上海生工有限公司测定细菌的16 S rDNA 序列，将所得菌株16 S rDNA 序列输入GenBank 数据库中进行BLAST 比对，同时从GenBank 中下载芽孢杆菌属多个序列，利用MEGA4.1 软件包进行序列比对，并采用邻接法（Neighbor-Joining method）分析同源性，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离菌菌落特征

沙塘鳢肝脏匀浆后涂布的培养基中未见有细菌长出，而在肠道涂布的普通营养琼脂平板中可见大量形态特征均一致的圆形菌落，菌落边缘呈锯齿状，表面粗糙呈白蜡状，经革兰氏染色，在显微镜的油镜下观察发现，革兰氏染色阳性，细菌呈杆状，紫色，以短链或长链分布，无荚膜，具运动性（图1）。

图1 SCYB2019 菌落特征及革兰氏染色

2.2 分离菌的生理生化特征

生理生化特征经API/ATB 半自动化细菌分析仪鉴定，表明菌株SCYB2019 隶属于芽孢杆菌属Bacillus sp.（表1）。

2.3 分离菌溶血性分析

在绵羊血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，菌落周围出现溶血环，见图2。

表1 SCYB2019 生理生化特征①

图2 SCYB2019 溶血活性

2.4 细菌的16 S rDNA 序列分析

菌株SCYB2019 的16 S rDNA 大小为1 480 bp，输入GenBank 数据库中进行比对，结果显示与苏云金芽孢杆菌序列具有100%的覆盖率和100%的同一性。采用邻接法构建其系统发育树见图3。由图3可见，从发育树中可以看出SCYB2019 与苏云金芽孢杆菌同源性达到90%以上，同时结合生理生化特征，鉴定菌株SCYB2019 为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），

3 讨论

图3 以16S rDNA 基因序列构建的系统发育树

沙塘鳢属鱼类分布于中国境内共有4 种，即河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢、海丰沙塘鳢（O.haifengensis）、中华沙塘鳢（O.sinensis）[5]。沙塘鳢（Odontobutis obscurus）又名河川沙塘鳢，还有乌草包、土布鱼等称谓，是鲈形目、塘鳢科、沙塘鳢属的鱼类，一般分布在我国长江水系中下游、闽江等水系中[6]。因其刺少肉多，肉质鲜嫩，营养丰富，所含人体必需的氨基酸比一般鱼类高等特点，故在江浙地区广受欢迎。河川沙塘鳢分布较广且自然资源量丰富，但个体较小，繁育周期长且不易被驯化吃饲料[7]。近些年，随着野生资源的急剧衰退和市场需求的不断增长，河川沙塘鳢已发展成为一个非常具有潜力的水产养殖新品种[8]。目前全国已经零星开展了沙塘鳢的混养和套养，但产量还远不能满足市场的消费需求[9]。

近年来，蜡状芽孢杆菌被认为是一种有益的微生物，开始用作益生素添加到食品和饲料中，部分菌株还作为植物生长促进剂使用[10]。在水产养殖中，也广泛开始使用蜡状芽孢杆菌制剂，不仅仅可以改善养殖水体富营养化，其代谢产物能够抑制病原菌和有害藻类生长，而苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌的区别在于苏云金芽孢杆菌携带杀虫质粒，能够编码形成芽孢孢外膜外的伴胞晶体，这使得蜡状芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌之间可相互转化[11]。目前，有学者鉴于苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌基因组的高度同源性，认为苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌应归为同一个种[12]，该次试验通过传统的16 S rDNA 分析，得到了分离到的细菌为苏云金芽孢杆菌的结论。

在养殖沙塘鳢肠道内的苏云金芽孢杆菌，极有可能是在使用含有蜡状芽孢杆菌的微生物制剂的过程中，蜡状芽孢杆菌转化为苏云金芽孢杆菌，而苏云金芽孢杆菌本身就携带肠毒素基因，能够造成养殖品种的病害。李丹蕾等[13]的研究表明，苏云金芽孢杆菌能够造成健康凡纳滨对虾死亡，并且表现出肝胰腺坏死的症状。这就要求在养殖过程中应用含有蜡状芽孢杆菌的微生态制剂时，有必要对这些菌株安全性进行系统的分析和评价。