酶法制备黑豆粕粉多肽的工艺研究

于 栋，高 洋，何新蕾

（1.漯河食品职业学院 食品工程系，河南 漯河 462300；2.漯河医学高等专科学校 基础医学部，河南 漯河 462300）

黑豆粕是黑大豆经过榨油后得到的不规则的硬块状的物质，一般为淡青色或浅褐色，有烤豆类的香味。在我国榨油所得的黑豆粕几乎都用于饲料行业中，作为饲料蛋白的原料，用来替代鱼粉[1]，但国外一些公司则大量购进黑豆粕，进行发酵或提取活性物质，来提高黑豆粕副产品的开发利用。黑豆粕中有40%的蛋白并没有得到真正利用，这样就会造成大量黑豆蛋白的浪费[2]。所以，利用黑豆粕粉制备出具有生物活性的黑豆粕多肽，对于黑豆产品的开发具有重要意义。

黑豆多肽是经过酶水解法或发酵方法所得的混合肽，其相对分子质量＜10 000 Da，含有不同的氨基酸序列[3]。黑豆多肽溶液中不仅含有人体所需的8种必需氨基酸，而且含量较高。根据相关研究显示[4]，人体摄入的蛋白质并不完全是以单个的氨基酸被机体吸收利用的，小分子的多肽与单个氨基酸相比，小分子的肽更易于吸收[5]，在机体发挥重要的作用。有资料表明[6-9]，黑豆多肽具有抗氧化性，可以及时清除体内多余的自由基，对于增强机体抵抗疾病的侵袭具有十分重要的意义[10-12]；同时适量摄入黑豆多肽还可以有效的缓解体力疲劳[13]。黑豆多肽对于心血管疾病患者也有一定的预防作用[14]。由于其价廉易得，安全性高，因此具有良好的开发前景[15]。目前制备黑豆多肽的方法主要有化学法、酶解法和超声波辅助提取法[16-18]。酶解法由于所得的产物没有毒性，对机体不会产生副作用，而且操作条件易控制，所以是制备生物活性肽最常用的方法[19-20]。任海伟等[21]以黑豆豆渣为原料，分别采用木瓜蛋白酶（温度50 ℃、pH6.5条件下水解3 h）、碱性蛋白酶（pH9.0条件下水解3 h）处理黑豆豆渣，最终得到的产物中氨基酸态氮含量为2.17%，溶解度为98.25%。

该研究以黑豆粕粉为原料，通过酶解法制备具有生物活性的黑豆多肽，主要采用响应面法对影响黑豆多肽酶解的时间、温度、pH、酶添加量等因素进行优化，以期为黑豆类产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆粕粉：苏州市黑土地食品有限公司；风味蛋白酶（2.6×105U/mL）、中性蛋白酶（2.5×105U/mL）、碱性蛋白酶（2.8×105U/mL）、木瓜蛋白酶（2.0×105U/mL）、胰蛋白酶（2.5×105U/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司；盐酸（分析纯）：开封东大化工有限公司试剂厂；甲醛（分析纯）：西陇化工股份有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

85-2型数显恒温磁力搅拌器：金华市瑞华试验仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；YP3002型电子天平：北京京国艺科技发展有限公司；722型分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；DELTA 320 pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；LD5-10低速离心机：北京医用离心机厂。

1.3 试验方法

1.3.1 黑豆粕粉蛋白溶液的制备

除脂肪→碱提→离心分离→收集上清液→酸沉→离心分离→收集沉淀→中和→水洗→黑豆粕粉蛋白溶液

黑豆粕粉过50目筛后，用石油醚回流脱脂6 h；在脱脂后的黑豆粕粉中按照1∶50的比例加水，用0.05 mol/L的NaOH调pH9.0～10.0，然后用4 000 r/min离心5 min、取上清液；加0.01 mol/L盐酸调pH到4.0沉淀蛋白，将沉淀的蛋白用蒸馏水进行清洗，之后加入1∶50的水，再用0.05 mol/L的NaOH调至中性，得到黑豆粕粉的蛋白溶液。

1.3.2 蛋白酶的筛选

分别将3%的风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶加入黑豆粕粉蛋白溶液中，调节至各酶最适的酶解温度和pH，分别酶解0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，酶解过程中保持pH的恒定。酶解结束后，煮沸灭酶10 min，然后离心（4 000 r/min，5 min）、取上清液，测定蛋白水解度，比较5种酶的酶解效果。5种不同酶的酶解条件见表1。

表1 不同种类蛋白酶酶解条件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different kinds of protease

1.3.3 单因素试验

确定最佳蛋白酶后，选择酶解温度、酶解pH、酶解时间、加酶量为因素进行单因素试验。其中，酶解温度设定为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃；酶解pH设定为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0；酶解时间设定为2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h；加酶量设定为1%、2%、3%、4%、5%。酶解结束后，煮沸灭酶10 min，然后离心、取上清液，测定上清液中的氨基酸肽氮含量，计算蛋白水解度。通过比较水解度的大小，确定各因素酶解工艺最适的条件。

1.3.4 黑豆粕粉多肽的工艺优化

以酶解温度（A）、酶解pH（B）、酶解时间（C）和加酶量（D）为影响因素，蛋白水解度（Y）为评价指标，运用Design Expert V8.0.6进行响应面试验，对黑豆粕粉多肽的制备工艺进行优化。响应面试验因素与水平见表2。

表2 黑豆粕粉多肽制备工艺优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for black soybean meal polypeptide preparation process optimization

1.3.5 水解度的测定

采用pH-stat法测定蛋白质水解度（degree of hydrolysis，DH），水解度计算公式如下：

式中：CNaOH为标准氢氧化钠的物质的量，mol/L；VNaOH为标准氢氧化钠溶液的体积，mL；MP为底物蛋白质的质量（g）；α为氨基的平均解离度；htot为黑豆粕粉蛋白质的肽键总数。α=（pH为试验时采用的pH，pK为氨基的解离常数，取7.0）。

1.3.6 多肽得率的测定

取7支试管，分别加入0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的10 mg/mL标准蛋白质溶液，用水补足至1 mL，然后加入4 mL双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25 ℃）下放置30 min，于波长540 nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以蛋白质的含量（x）为横坐标，OD540nm值（y）为纵坐标绘制标准曲线。

通过线性回归得到的标准方程为y=0.051 5x+0.007 3，R2=0.999 3。可溶性多肽含量计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 黑豆粕粉蛋白酶的选择

对比5种蛋白酶对黑豆粕粉蛋白水解效果，结果见图1。由图1可知，所选5种蛋白酶酶解3 h后，黑豆粕粉蛋白的水解度基本不变，且从各自的变化情况来看，碱性蛋白酶对黑豆粕粉的水解效果最好，最高水解度为16.6%，胰蛋白酶次之，水解度为11.2%，风味蛋白酶水解效果最差，水解度为5.2%。由于酶都具有专一性，每个蛋白酶作用的酶切位点不同，导致水解出来的多肽长短不同，数量不同[22]。碱性蛋白酶是以丝氨酸蛋白酶为主，对羧基侧为芳香族的氨基酸（Tyr、Phe、Trp）水解能力最强；木瓜蛋白酶是以Arg、Lys、Gly、Cys为酶切位点；风味蛋白酶主要是氨肽酶与羧肽酶的复合，酶解能力较弱。因此，选择碱性蛋白酶对黑豆粕粉进行水解。

图1 不同蛋白酶对黑豆粕粉蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶解温度对黑豆粕粉蛋白水解效果的影响

图2 酶解温度对黑豆粕粉蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on protein hydrolysis degree of black bean meal

由图2可知，酶解温度为50～60 ℃时，水解度的变化较快，当酶解温度为55 ℃时，水解度达到最大值。这是因为酶制剂都有一个合适的温度范围，当超过这个温度范围，酶制剂的活性会减低，进而使得水解程度的下降。所以选择55 ℃作为最适的酶解温度。

2.2.2 酶解pH对黑豆粕粉蛋白水解效果的影响

由图3可知，随着酶解pH值的增加，水解度先增大后减小，在酶解pH值为9时，水解度最大。这是由于酶制剂在最适的pH环境内，活性达到最佳，过高或过低的pH值，都会阻碍酶制剂与底物的结合。因此，选择最适酶解pH值为9。

图3 酶解pH对黑豆粕粉蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH value on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.2.3 酶解时间对黑豆粕粉蛋白水解效果的影响

图4 酶解时间对黑豆粕粉蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on protein hydrolysis degree of black bean meal

由图4可知，黑豆粕粉水解度随着酶解时间的增加呈先增加后趋于平稳的趋势。当酶解时间为1～3 h时，水解度的增加较快；当酶解时间为3 h时，水解度达到最大值，为24.4%；继续延长酶解时间，水解度增加十分缓慢。这是由于蛋白酶刚接触底物时，发生剧烈的水解反应，蛋白质上的氨基酸被大量切开，但当酶制剂作用位点上的氨基酸都被切开后，水解度基本不再增加。因此，选择最佳酶解时间3 h为宜。

2.2.4 加酶量对黑豆粕粉蛋白水解效果的影响

由图5可知，随着加酶量的增加，水解度呈逐渐上升趋势。当加酶量为4%时，黑豆粕粉蛋白的水解度达到最大值33.3%；当加酶量＞4%时，水解度趋于平缓。这可能是因为当酶的添加达到一定量时，其与底物的接触已趋于饱和，水解度不再增加。因此，选择加酶量4%为宜。

图5 加酶量对黑豆粕粉蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of enzyme addition on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.3 响应面试验

根据单因素试验结果，以酶解温度（A）、酶解pH（B）、加酶量（C）和酶解时间（D）为影响因素，以黑豆粕粉蛋白的水解度（Y）为响应值，进行响应面试验，优化酶解参数，确定黑豆粕粉酶解的工艺条件。响应面试验设计与结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 黑豆粕粉多肽制备工艺优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology for black soybean meal polypeptide preparation process optimization

表3 回归方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation model

由表3方差分析结果可看出，模型P＜0.000 1，方程模型达到极显著，失拟P=0.278 1＞0.05，不显著，因此二次模型成立，应用此模型可以预测黑豆粕粉蛋白提取率及微波法辅助提取蛋白的工艺。由此获得二次多项回归方程：

Y=33.88+1A+1.41B+1.34C+1.82D-1.96AB-1.17BC+1.48BD-5.12A2-2.67B2-0.26C2-3.49D2，方程的决定系数为0.978，说明该模型能解释97.8%响应值的变化，即该模型与实际试验拟合良好，试验误差小。

由表3可知，方程模型极显著，二次模型成立，由方程的复相关系数为0.978可知，得出的模型与实际试验拟合良好，误差小，可以用此模型预测黑豆粕粉蛋白的最佳水解工艺。酶解温度与酶解pH、酶解pH与加酶量都有交互作用都到达显著水平（P＜0.05），酶解pH与酶解时间交互作用极显著（P＜0.01）。为确定最佳工艺，通过Design Expert V8.06软件绘制响应面，结果见图6。

由图6可知，由于回归方程的二次项系数均为负值，且响应面的开口向下，说明建立的方程有极大值。碱性蛋白酶水解黑豆粕粉的最佳制备条件为：酶解温度55.43 ℃、酶解pH9.05、酶解时间4.34 h、加酶量4.34%。在此最佳条件下，蛋白水解度预测值为35.37%。为方便实际操作，将多肽的最佳制备条件修正为：酶解温度55 ℃、酶解pH9、酶解时间260 min、加酶量4.3%。在此条件下，经3次验证试验，蛋白水解度为35.23%，与预测值相接近，说明方法可行。

图6 酶解温度、酶解pH、酶解时间与加酶量交互作用对黑豆粕粉蛋白水解度影响的响应面Fig.6 Response surface plots of effects of interaction between enzymolysis temperature,pH,time and enzyme addition on protein hydrolysis degree of black soybean meal

3 结论

本研究采用酶解法制备黑豆多肽。以水解度为考察指标，从风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶中筛选水解效果最好的蛋白酶。通过单因素试验考察酶解pH、加酶量、酶解温度、酶解时间水对水解效果的影响，在此基础上，采用响应面试验对黑豆粕粉多肽的制备条件进行优化。结果表明，碱性蛋白酶最适合酶解黑豆粕粉多肽，多肽的最优制备条件为酶解温度55 ℃、酶解pH 9、酶解时间260 min、加酶量4.3%。在此优化条件下，蛋白的水解度为35.23%，与预测值相接近。为黑豆类产品的开发提供了参考。