华东地区掌叶覆盆子的表型特征和基于ISSR标记的遗传分析△

孙健，任江剑a，华金渭，沈晓霞，王志安

1.浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2.丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000

覆盆子为掌叶覆盆子RubuschingiiHu的干燥未成熟果实，具有益肾固精缩尿、养肝明目之功效[1]，临床上常用于治疗遗精滑精、遗尿尿频、阳痿早泄、目暗昏花[2]，主要分布于我国华东地区的浙江、广西、江西和福建等省。现代药理研究表明，其具有抗肿瘤、抗氧化、调节血糖和血脂、抗衰老和抗炎等药理作用[3-4]。分子鉴定技术在中药材基原的区分和伪品鉴别中可以起到定性判别的作用[5]，其中以核糖体内部转录间隔区(ITS)序列和叶绿体psbA-trnH应用最多[6-7]。物种内部不同地理宗、居群或品种的区分需要更多的基因信息进行区分，对于无参考基因组的植物，往往采用随机引物进行初步的研究，如相关序列扩增多态性(SRAP)、简单重复间序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)等标记体系。其中，ISSR分子标记是全基因组多样性分析的通用标记，具有多态性高、操作简便等优点，至今仍用于植物群体遗传组成的初步分析[8-11]。近年，浙江及周边省份覆盆子产业发展迅速，人工引种栽培面积超过8万亩(1亩≈666.67 m2)，而有关覆盆子资源的系统分析未见报道。本研究系统记录了华东地区24份掌叶覆盆子资源的主要表型，利用ISSR标记对华东产区掌叶覆盆子与其近似种进行遗传分析，明确了掌叶覆盆子与悬钩子属近缘植物红树莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花悬钩子R.trianthusFocke、盾叶莓R.peltatusMaxim.的亲缘关系和掌叶覆盆子种内的遗传多样性特征，为掌叶覆盆子的基原鉴定和新品种选育提供参考。

1 材料

1.1 样品

2017年收集华东各地的野生掌叶覆盆子资源24份，收集近缘的悬钩子属植物5份。其中，1份树莓样品为国外引种的红树莓R.idaeus栽培种，山莓和茅莓采集自于杭州市西湖区，三花悬钩子采集于台州市石梁镇，盾叶莓采集于杭州市藻溪镇。各样品统一栽培于丽水市农科院试验基地。2019年开花后，植物基原由丽水市农林科学研究院华金渭研究员鉴定，结合花器官表型[12]和ITS序列信息(分子鉴定参考吕群丹等[13]方法)鉴定为掌叶覆盆子RubuschingiiHu、红树莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花悬钩子R.trianthusFocke、盾叶莓R.peltatusMaxim.。24份掌叶覆盆子材料来源和表型见表1。

表1 掌叶覆盆子来源和表型特征

1.2 试药

聚合酶链式反应(PCR)扩增试剂为2×HieffTMPCR Plus Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)。三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、β-巯基乙醇、三氯甲烷、异戊醇均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

Veriti 96 Well Thermal cycler型PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Gel DocTMXR+型凝胶成像仪、PowerPac Basic型电泳仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)；Legend Micro 17型高速离心机(美国Thermo公司)；M200 Pro型多功能酶标仪(美国Tecan公司)；Tissue Lyser Ⅱ型组织研磨器(德国Qiagen公司)。

2 方法

2.1 表型记录

参考同属植物树莓和月季的表观性状分类体系[14-15]，结合掌叶覆盆子生物学特征，选取8个表观性状进行观察记录。每份样品随机选取5个单株，群体内质量性状出现变异的以多数个体表现的性状为准。于2019年3月观察孕蕾期2年生枝条主干的颜色，定义茎干颜色为绿色和红色；统计2年生枝条主干离地40～55 cm处皮刺数量(N)，定义皮刺密度为密集(N≥30)、中等(30>N≥15)、稀疏(N<15)3个级别；定义叶形为7裂叶、5裂叶2种；根据果期幼叶尖端是否为红色，定义幼叶色苷类型为有、无 2种；定义花瓣基部至外缘顶端的距离为花瓣长；定义连接枝干和果实之间的果柄的距离为果柄长；根据果实顶端型态，定义果型为渐尖、截平2种类型；定义药材采收期，即绿转黄期果实的干质量为果质量。

2.2 ISSR标记扩增

每份样品随机选取嫩叶10片，采用十六烷三甲基溴化胺(CTAB)法提取样品材料中的基因组DNA，用1×TE缓冲液调整其质量浓度为100 ng·μL-1。扩增反应体系为基因组DNA模板1 μL(约100 ng)、引物1 μL(10 μmol·L-1)、MgCl2溶液(25 mmol·L-1)1 μL、Mix-Taq10 μL和ddH2O 7 μL，总体积为20 μL。扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。以24份样品等量混样提取的总DNA为模板，采用ISSR引物进行多态性筛选。ISSR标记引物为加拿大哥伦比亚大学公布的引物。以ISSR引物分别扩增PCR产物，PCR产物在含有染料的2%琼脂糖凝胶中电泳后用成像仪拍照，引物序列见表2。

表2 ISSR标记及其扩增结果

2.3 数据分析

应用SPSS 16.0软件，将表观性状数标准化处理后进行相关性分析和聚类分析；应用POPGENE 1.32软件对ISSR条带数据的遗传多样性进行分析；应用NTSYS-pc 2.10软件基于UPGMA方法，构建聚类树状图。

3 结果

3.1 掌叶覆盆子表型特征分析

24份掌叶覆盆子资源来源覆盖覆盆子的主产区。结果表明，掌叶覆盆子表型丰富，8个表观性状包括5个质量性状和3个数量性状。掌叶覆盆子的药材采收期为处于青色转黄时期的未成熟果实[16]，记录药材采收期的果干质量。相关性分析表明，花瓣长度和产量性状果质量有正相关关系，其他性状之间没有显著的相关性(表3)。由于花瓣长和果质量性状间有相关关系，且果质量为果实快速发育期性状，因此，基于表型性状的聚类分析，选用了茎干颜色、皮刺密度、叶形、幼叶色苷、花瓣长、果柄长、果型7个性状。聚类结果显示，上述7个表观性状可以较好地区分和描述华东地区的掌叶覆盆子资源(图1)。同时，基于7个表观特征数据的聚类结果分析，表型特征与地域分布无关。对比分子数据聚类结果没有呈现出显著的区域间表型分化。

图1 基于表型数据的掌叶覆盆子聚类分析图

表3 掌叶覆盆子表型性状间相关性

3.2 ISSR标记扩增产物多态性分析

应用8条扩增谱带清晰并呈多态性的ISSR引物(图2)对29份材料进行扩增，对24份掌叶覆盆子资源的标记多态性进行统计，共检测到90个位点。其中，多态性位点58个，占比64.44%(表2)。

注：M.DNA Maker；1～24.掌叶覆盆子样品的带型；25～29.山莓、茅莓、三花悬钩子、红树莓和盾叶莓样品的带型。

3.3 遗传距离和聚类分析

本研究中，掌叶覆盆子种质资源间的遗传相似系数为遗传相似系数为0.536 6～0.878 0，平均值为0.715 7。其中，遂昌和南屏的材料遗传相似性系数最低，为0.536 6；临岐和建德的材料遗传相似性最高，为0.878 0。该结果表明，本研究中掌叶覆盆子材料的整体遗传相似性较大，来自不同地域的材料也存在较大的差异。应用NTSYS-pc软件分析供试材料间的遗传相似系数，基于UPGMA方法，构建聚类树状图(图3)。本研究的公示材料均为ISSR标记信息，可以明确区分掌叶覆盆子与近缘悬钩子植物，悬钩子属(Rubus)空心莓组(Sect.Idaeobatus)植物，山莓和三花悬钩子与掌叶覆盆子均为单叶，且花着生于小枝顶部，属于球果亚组(Subsect.Corchorifolii)，聚类的亲缘关系较近；红树莓和茅莓均为复叶，分属于绒毛叶亚组(Subsect.Stimulantes)和伞房花序亚组(Subsect.Idaeanthi)，两者遗传距离较近；而盾叶莓属于盾叶亚组(Subsect.Peltati)，为单生叶，聚类于茅莓与球果亚组植物之间。在相似系数为0.67～0.70处24份掌叶覆盆子资源又可进一步聚为浙北、浙南和闽北3组，说明不同地域的掌叶覆盆子出现了一定的遗传分化。以浙北、浙南和闽北为群体，应用POPGEN软件，进一步分析可知区域间群体的遗传距离<0.253 8、遗传一致度>0.775 9、基因分化系数(Gst)为0.320 3、基因流(Nm)为1.061 2，说明3个区域群体间的遗传分化不明显。

图3 基于ISSR标记信息的掌叶覆盆子与近缘植物聚类分析图

3.4 遗传多样性分析

在物种水平上，掌叶覆盆子的基因多样性指数(H)=0.272 0、Shannon′s信息指数(I)=0.412 7(表4)，说明该物种的基因遗传多样性较高。浙南地区的掌叶覆盆子H高于浙北地区，而I低于浙北区域。该结果可解释为浙北地区每份资源平均的基因多样性较高，而浙南地区不同材料间的有效等位基因数差异较大。闽北地区的供试的材料数量较少，导致H和I较低，不能显示区域内物种的遗传多样性，需要加大样本做进一步研究。

表4 基于ISSR标记信息的掌叶覆盆子遗传多样性参数

4 讨论

4.1 药用覆盆子的种源引种与选育

从物种基原的水平上分析，中药材覆盆子基原植物呈现逐渐纯化的过程。传统中药材覆盆子来源丰富，历史上诸多蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物的果实被当作“覆盆子”入药，传统医药书籍中记载的覆盆子基原植物名称有“蓬藟”“插田泡”“茅莓”“覆盆子”“黄果悬钩子”“寒莓”等，随时间推移，医家逐渐明确“覆盆子”为植物掌叶覆盆子的未成熟干燥果实[17]。目前，《中华人民共和国药典》2020年版收录的覆盆子的基原植物也只有掌叶覆盆子[3]。本研究的全基因组的分子标记研究表明，掌叶覆盆子与近缘的悬钩子属植物有明显的物种分化。与此同时，掌叶覆盆子相对于其他悬钩子属近缘植物的药理效果系统评价还有待进一步研究。本研究基于ISSR标记信息对物种的区分与聚类结果与Yan等[18]基于叶绿体基因(rbcL、rpl20-rps12、trnG-trnS)和核基因(ITS、GBSSI-2、PEPC)的悬钩子属植物聚类结果是一致的，表明ISSR标记体系可以较好地区分悬钩子属近缘植物。目前，掌叶覆盆子已经形成了一定的种植规模，其种植模式仍处于原地野生资源引种繁育阶段，还没有稳定的优质药用品种育成。综上所述，掌叶覆盆子的ISSR标记基因多样性较高、种质区分性较好、研究效率高，可以运用于种质区分和遗传研究工作。

4.2 掌叶覆盆子的遗传结构与分化

掌叶覆盆子物种水平上H=0.272 0、I=0.412 7，高于濒危植物五小叶槭[19]、稀有药用植物滇重楼[20]、已经驯化的植物黄瓜[21]，与华南广布的华中五味子相当[22]，表现出中等偏高的遗传多样性。植物种群的遗传多样性变化与物种自身的繁育系统、遗传漂变、基因突变，以及外部环境变化、人类活动导致的种群隔离和生境片断化、异地引种等诸多因素相关[23-24]。华东地区掌叶覆盆子整体呈现出较高的遗传多样性，该结果与掌叶覆盆子为虫媒花、生长年限久、可以依靠鸟类长距离传播等生物特征相关。与此同时，聚类分析结果显示，在遗传相似系数0.67～0.70处，供试样品呈现出区域分化的现象，导致该现象的原因可能与不同纬度地区群体的花期不遇，生长区域因人为活动产生隔离等原因相关。虽然，掌叶覆盆子的野生群体具有较高的遗传多样性，但是在掌叶覆盆子的引种驯化过程中，往往采用根蘖芽无性繁殖，该操作导致基因多样性的下降，进而加大病虫害大规模爆发的风险[25-26]。因此，在发展掌叶覆盆子产业的同时，应注意保护野生掌叶覆盆子资源，同时注意引种资源的品种更新。