忘忧安神方标准煎液HPLC指纹图谱建立及4种成分含量测定△

汪莉，贾妙婷，孙天雄，冯慧敏，李玥，祝健鸿，何军刚，李波，强正泽，李成义

甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000

传统汤剂在中医临床应用中较为广泛且疗效显著，但其制备、携带不便，服用剂量大。在中药新剂型的研发和生产过程中，保证其成品与传统汤剂的化学和生物等效性是剂型变革的核心，用适宜的方法和标准评价现代制剂质量与传统汤剂的一致性，有助于保障中医临床用药更加安全有效[1]。标准汤剂、标准煎液、物质基准均是以中医理论为指导，保持原方疗效为目的，以传统制法为依据，经统一化、标准化工艺制备而成的制剂中间体[2-4]，在融合现代制备工艺的基础上极大限度保存了传统汤剂的完整性，其代表了制剂的整体内在质量，以这个中间体为基础，可实现对制剂原料药的追溯以及向成品制剂的延伸，是经典名方乃至所有中药及其复方制剂研发的基准[5]，可用于评价制剂的制备工艺、药效和质量标准，是现代中药研究的热点与发展趋势[6]。

甘麦大枣汤出自医圣张仲景的《金匮要略》，为安神剂，具有养心安神、和中缓急之功效，主治情志不舒、思虑过度、躁扰不宁的脏躁症[7]。现代研究表明[8]，甘麦大枣汤具有镇静、催眠、抗抑郁等药理作用。忘忧安神方是以经典名方甘麦大枣汤为基础方，由甘肃地产药材黄花菜及栀子等多味药食同源的中药组方而成。方中君药黄花菜，又名金针菜、忘忧草等，味甘而微凉。《本草纲目》记载其有利湿热、宽胸膈、安五脏、安寐解郁，治酒疸等作用[9]。该药与方中其他药合用，共奏滋阴降火、舒肝和胃、养心安神、平衡阴阳之功效。对目前社会环境因素影响及工作强度加大导致人群中出现的身体乏力、消化功能减弱、睡眠质量下降等亚健康问题具有较好的临床疗效。

本课题组前期已优化处方标准煎液提取工艺，方法稳定，拟开发为疗效持久、服用剂量小、质量稳定、携带方便、更易于被患者所接受的口服液制剂。为了保证忘忧安神方后续研发的口服液制剂能保持原方的疗效与特点，有必要建立原组方标准煎液的质量控制方法。本研究遵循经典名方遵古溯源的研究思路[10]，以复方标准煎液为切入点，采用高效液相色谱法(HPLC)建立忘忧安神方标准煎液指纹图谱，通过单味药及阴性样品指纹图谱对其中的色谱峰进行溯源研究，以获得专属的、整体的化学特征综合信息，并结合多指标成分测定[11]，建立忘忧安神方全面、有效而切实可行的质量评价体系，为后期成品口服液制剂的质量标准研究及饮片-标准煎液-成品制剂的量值传递相关性研究奠定基础，同时，可为基于中药标准煎液的中药临床验方研究及新药开发提供有益的研究经验和技术参考。

1 材料

1.1 仪器

Aglient 1260型二极管阵列检测器(DAD)高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；CAV214C型电子分析天平(美国奥豪斯公司)；80-1型电动离心机(金坛市恒丰仪器厂)；YRE-301型旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；Milli-Q Century型超纯水机。

1.2 试药

对照品栀子苷(批号：Y25J9C53637)、甘草苷(批号：Z28M10X84164)、槲皮苷(批号：P19D10F106420)、甘草酸铵(批号：P13A9L67602)均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%；乙腈(批号：20200302)、磷酸(批号：20160307)均购自天津大茂化学试剂厂，均为色谱纯。

收集忘忧安神方处方饮片各10批，其中黄花菜购于各地药材市场，其在《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版中未记载，经甘肃中医药大学药学院李成义教授鉴定为百合科萱草属植物黄花菜HemerocalliscitrinaBaroni的干燥花蕾；其余饮片采购于各大零售药店，经前期的鉴定及初步质量评价，均符合《中国药典》2015年版规定。

2 方法与结果

2.1 全方含量测定方法建立

2.1.1色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，5%～22%A；15～26 min，22%～34%A；26～34 min，34%～60%A；34～42 min，60%～70%A；42～45 min，70%～5%A)；记录时间为 45 min；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：237 nm(栀子苷、甘草苷)、254 nm(槲皮苷、甘草酸)；进样量：10 μL。

2.1.2混合对照品制备 分别精密称取栀子苷6.14 mg、甘草苷0.92 mg、槲皮苷1.95 mg、甘草酸铵2.32 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为栀子苷614 μg·mL-1、甘草苷92 μg·mL-1、槲皮苷195 μg·mL-1、甘草酸铵232 μg·mL-1的混合对照品母液，备用。

2.1.3供试品溶液制备 分别称取忘忧安神方处方饮片随机组方 T1～T10，按课题组前期研究标准煎液最佳提取工艺，即加 10倍量水，浸泡1 h，武火煮沸后改用文火，煎煮3次，每次1 h，滤过；合并滤液，浓缩并定容至500 mL(生药量为0.31 g·mL-1)，得全方标准煎液，精密量取标准煎液2 mL，加70%甲醇8 mL，称质量，超声30 min，补足减失的质量，5000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm)，上清液过0.45 μm滤膜，既得供试品溶液。

1.学生明确体育训练目的，形成正确的体育训练动机。体育训练的目的与体育训练的动机是紧密联系的。教师应重视加强体育训练目的和意义的教育，启发引导，注意培养学生的内在动力，才能培养学生体育训练的兴趣。只有使学生形成正确的体育训练动机，才能发挥学生的主体作用。

2.1.4方法学考察

2.1.4.1线性关系考察 分别精密量取混合对照品母液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL于5 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，得到系列混合对照品溶液，用 0.45 μm微孔滤膜滤过，进样。以各对照品的质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标，通过计算，得线性方程，结果表明，各对照品在相应浓度范围内线性关系良好，见表1。

表1 忘忧安神方标准煎液中4种成分的线性关系

2.1.4.2精密度试验 取T1供试品溶液，连续进样6次，按2.1.1项下色谱条件进样检测，得各指标性成分保留时间RSD均小于1%，峰面积的RSD均小于4%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3稳定性试验 取T1供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、36 h，按2.1.1项下色谱条件进样检测，得各指标性成分保留时间RSD均小于1%，含量RSD均小于3%，表明各指标成分在36 h内稳定性良好。

2.1.4.4重复性试验 取T1供试品溶液6份，按2.1.1项下色谱条件进样检测，得各指标性成分保留时间RSD均小于1%，峰面积RSD均小于3%，表明仪器重复性良好。

2.1.4.5加样回收率试验 精密量取已知含量的T1标准煎液2 mL，加入适量的各对照品溶液，按2.1.3项下方法制备，按2.1.1项下色谱条件进样检测，计算4种指标成分的平均加样回收率为95%～105%，RSD均小于3%，见表2。

表2 忘忧安神方标准煎液中4种成分含量测定的加样回收率试验结果(n=6)

2.2 10批标准煎液含量测定

取上述10批忘忧安神方标准煎液T1～T10，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进行进样分析，记录色谱峰，分别代入回归方程，计算10批忘忧安神方标准煎液中栀子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸含量，结果见表3、图1。结果表明，10批忘忧安神方标准煎液中栀子苷质量分数为36.84～55.86 mg·g-1、甘草苷质量分数为3.96～6.57 mg·g-1、槲皮苷质量分数4.59～13.76 mg·g-1、甘草酸质量分数为16.64～21.14 mg·g-1，不同批次间4种成分含量差异较大，表明不同批次的原药材质量存在差异。

表3 10批忘忧安神方标准煎液中4种成分的含量测定结果 mg·g-1

图1 混合对照品和忘忧安神方标准煎液供试品溶液的HPLC图

2.3 全方标准煎液指纹图谱建立

2.3.2对照品制备 精密吸取2.1.2项下对照品母液1 mL，加甲醇定容至5 mL，制成质量浓度分别为栀子苷122.8 μg·mL-1、甘草苷18.4 μg·mL-1、槲皮苷39 μg·mL-1、甘草酸铵46.4 μg·mL-1的混合对照品溶液，既得。

2.3.3供试品溶液制备

2.3.3.1全方供试品制备 分别精密量取2.1.3项下标准煎液T1～T10各2 mL，加蒸馏水定容至10 mL，5000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm)，上清液过0.45 μm滤膜，既得全方指纹图谱供试品溶液。

2.3.3.2单味饮片溶液制备 按照各单味药在全方中的配比，分别称取各单味药，按2.3.3.1项下方法制备单味饮片供试品溶液。

2.3.3.3阴性样品溶液制备 分别称取除各单味药的其余药材，按2.3.3.1项下方法，制备缺各单味药的阴性对照溶液。

2.3.4方法学考察

2.3.4.1精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(T1)，按2.3.1项下色谱条件连续进样 6 次，记录色谱图。以峰面积较大、出峰时间稳定的栀子苷为参照峰，计算得到各特征峰相对保留时间的RSD<0.5%，相对峰面积的RSD<3%，相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.3.4.2稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(T1)，按2.3.1下色谱条件分别于 0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。以栀子苷为参照峰，计算得到各特征峰相对保留时间的 RSD<0.5%，相对峰面积的 RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.3.4.3重复性试验 精密吸取6份T1的样品溶液，按2.3.3.1项下方法制备供试品溶液 6 份，再按2.3.1项下色谱条件进样，记录色谱图。以栀子苷为参照峰，计算得到各特征峰相对保留时间的RSD<0.2%，相对峰面积的RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明方法具有较好的重复性。

2.4 10批标准煎液指纹图谱相似度评价及色谱峰归属和指认

2.4.1指纹图谱相似度评价 按照2.3.1项下色谱条件，对10批标准煎液进行指纹图谱测定，记录图谱。将10批标准煎液的指纹图谱测定结果以AIA格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)，以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.2 s，通过多点校正后，采用平均数相关系数法进行图谱自动匹配，生成10批样品共有模式图谱，10批标准煎液的 HPLC指纹图谱及其共有模式图谱(R)见图2。进行相似度计算，结果显示，10批样品与对照指纹图谱相似度分别为0.985、0.967、0.943、0.988、0.975、0.988、0.989、0.976、0.987、0.995。说明样品制备方法及所建立指纹图谱稳定可靠，能反映忘忧安神方标准煎液整体特征，可作为其质量控制的参照依据。

图2 10批忘忧安神方标准煎液指纹图谱及其对照指纹图谱

2.4.2共有峰确立及指标成分标定 对10 批次忘忧安神方标准煎液 HPLC 共有模式图谱进行分析后，确定了36个共有峰。通过与混合对照品图谱比对，确定17号峰对应栀子苷，24号峰对应甘草苷，26号峰为槲皮苷，35号峰对应甘草酸，见图3。

注：17.栀子苷；24.甘草苷；26.槲皮苷；35.甘草酸。

2.4.3色谱峰归属分析 取各单味药溶液、阴性供试品溶液、全方供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，记录各色谱图。将各单味药、阴性、全方共有模式色谱峰进行匹配，同时比对各共有峰保留时间及紫外光谱图，确定各共有峰归属。结果显示，各单味药对共有峰的贡献程度有所差异，君药黄花菜及栀子、甘草、合欢花4味药对共有峰贡献较大，其他各味药对共有峰贡献不大，但在指纹图谱中均有体现，表明所建立的指纹图谱可以反映忘忧安神方主要药效物质组成。

3 讨论

本研究建立了忘忧安神方中4种成分的 HPLC含量测定方法及指纹图谱质量评价方法，考察确定了指标性成分的选择、提取溶剂、色谱条件。

3.1 指标成分选择

为了与传统汤剂保持一致，本研究标准煎液的提取以水为溶媒，并结合与忘忧安神方处方组成相似的复方制剂相关的研究及《中国药典》2015年版中饮片含量测定指标[12-13]，确定性质稳定且水溶性较好、含量相对较高且具有解郁安神作用的栀子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸4种成分作为含量测定成分[14-16]，同时，这4种成分具有较好的专属性，栀子苷为栀子的指标性成分，甘草苷、甘草酸为甘草的指标性成分，槲皮苷为合欢花的指标性成分，建立其含量测定的方法，可为后期忘忧安神方中栀子、甘草、合欢花饮片-标准煎液-成品制剂的转移率研究奠定基础。

3.2 提取溶剂

含量测定时分别考察了水、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂，结果发现，70%甲醇作为提取溶剂时4种成分的含量相对较高，故最终确定70%甲醇为含量测定提取溶剂。

3.3 色谱条件

在含量测定波长选择过程中，DAD对栀子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸铵对照品进行全波长扫描(190～400 nm)，结果栀子苷、甘草苷在237 nm左右有最大吸收，槲皮苷、甘草酸的最大吸收波长分别为256、252 nm。综合分析将237 nm作为栀子苷、甘草苷含量测定波长，254 nm作为槲皮苷、甘草酸含量测定波长。

由于大多数化学成分在254 nm均有紫外吸收，故在指纹图谱的前期研究过程中选择254 nm作为指纹图谱测定波长，结果栀子苷与其他色谱峰相应值差别较大，因此，选择254 nm附近的波长：250、252、256、258、260、265 nm，最终发现260 nm下各色谱峰响应值均较高，峰形较好且基线平稳，故确定指纹图谱测定波长为260 nm。

流动相分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的洗脱效果。结果乙腈-水的色谱峰的数量少且峰形不好，加入适量的酸后色谱峰变得丰富，而含0.1%甲酸流动相洗脱后色谱峰分离度略优于0.1%磷酸。增加甲酸含量至0.2%后，色谱峰峰形及分离度几乎没有变化，由于酸性过强容易对色谱柱造成损耗，最终确定选择乙腈-0.1%甲酸作为指纹图谱流动相。

目前，很多学者致力于单味药材-饮片-标准汤剂-配方颗粒的研究[17-20]，也有少数学者对于经典名方标准汤剂(物质基准)进行研究[21-22]。中药用药讲求君臣佐使，即复方配伍的汤剂是中药用药的主要形式，本研究以复方标准煎液为模式标准，选择指纹图谱结合多指标成分定量分析的方法，建立忘忧安神方的质量控制技术及评价体系，在明确临床患者所用煎服汤剂的药学品质的基础上，进一步将这一标准用于后续的制剂研发和生产上，通过对饮片-标准煎液-成品制剂进行出膏率、指标成分转移率的快速测定及指纹图谱相似度分析，实现对单味饮片-中间体-成品制剂的量值传递相关性研究及制剂生产全过程质量控制，缩小成品制剂的批间差异，以保证制剂的有效物质群和质量基本稳定。另外，通过将各单味饮片中各成分信息与全方标准煎液的比较，能够更好地提升中药配伍、组方的科学性和规范性。