肝细胞线粒体NDUFA13 蛋白缺陷可诱导小鼠自发性慢性肝纤维化

徐小惠，曾 欣，李 锐，冯金梅，黄道超，黄 轶

重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所//国家儿童健康与疾病临床医学研究中心//儿童发育疾病研究教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//儿童感染免疫重庆市重点实验室，重庆400014

肝纤维化是肝脏应对损伤进行自我修复的病理生理过程。各种慢性肝脏疾病过程中，肝细胞损伤与持续炎症刺激可导致肝星状细胞（HSCs）激活和细胞外基质（ECM）过度沉积加速肝纤维化病理进程［1］，从而促肝硬化甚至肝癌发生。近年来，肝纤维化发病率逐年上升，但仍然缺乏有效的防治手段［2］。因此，深入探讨肝纤维化的发病机制，寻找阻滞或逆转肝纤维化的有效靶点，对肝纤维化的早期防治具有重要意义。

NDUFA13是一种核基因编码的线粒体蛋白，主要定位在线粒体内膜，是组成NADH脱氢酶Ⅰ复合体的基本亚单位，对于线粒体呼吸链膜电位及氧化磷酸化功能维持至关重要［3］。大量研究发现NDUFA13作为一种抑癌基因，在多种恶性肿瘤组织中表达紊乱，参与多种信号通路而调控肿瘤细胞增殖、凋亡及细胞侵袭与转移等过程，且与疾病的预后密切相关［3-7］。课题组前期研究揭示了NDUFA13在胃癌癌前炎症恶性进展中渐进性下调的特点［6］，我们进一步证实NDUFA13蛋白失活可诱导小鼠自发性肝炎病理表型［8］。然而，NDUFA13蛋白缺失是否能够诱导小鼠肝脏纤维化的发生，仍需进一步证实。

目前，有关肝纤维化的药物或机制研究大多基于胆汁淤积、毒物诱导等干预的小鼠肝纤维化模型［9］，并不能很好地模拟人类肝脏慢性纤维化的疾病状态。因此，制备能模拟人类肝炎-肝纤维化病理进程的动物模型，是探索肝纤维化疾病发生机制与治疗手段的重要基础。本研究重点关注NDUFA13蛋白失活对肝纤维化形成的影响，以期为肝纤维化治疗提供新的靶点，同时提供一种自发性、慢性肝纤维化动物模型，为肝纤维化的发病机制研究及治疗药物筛选提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 NDUFA13fl/fl基因编辑小鼠、Alb-Cre转基因小鼠及肝脏特异性NDUFA13 杂合敲除小鼠（NDUFA13fl/-；Alb-Cre）参照前期实验方法获得［8］。C57BL/6小鼠购买于重庆医科大学实验动物中心。所有小鼠均饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心，SPF环境下（12 h/12 h光照/黑暗），自由采食与饮水。分别在4周龄、2年龄时处死小鼠，获取肝组织样本用于检测。所有操作均遵照实验动物伦理学要求（GDY1801016）进行。

1.1.2 主要试剂 蛋白裂解液（碧云天），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），NDUFA13小鼠抗人单克隆抗体（Santa cruz），小鼠抗β-actin 抗体（sigma），Western BrightTMECL显色试剂盒（Advansta），α-SMA小鼠抗人单克隆抗体（Bioss），Collagen-Ⅰ兔抗人多克隆抗体（Bioss），Collagen-Ⅲ兔抗人多克隆抗体（Bioss），MMP-9兔抗人多克隆抗体（Bioss），TIMP-1兔抗人多克隆抗体（Bioss），F4/80 大鼠抗小鼠单克隆抗体（Biolegend），TGF-β1兔抗小鼠多克隆抗体（Bioss），TNF-α小鼠抗人单克隆抗体（Bioss），IL-1β兔抗人多克隆抗体（Bioss），即用型免疫组化（兔）试剂盒（福建迈新），即用型免疫组化（小鼠）试剂盒（福建迈新），大鼠二步法试剂盒（中杉金桥），山羊抗兔Alexa-Fluor 555荧光二抗（Bioss），山羊抗小鼠Alexa-Fluor 647荧光二抗（Bioss）。

1.1.3 主要仪器 台式高速离心机（Thermo Fisher Scientific），凝胶电泳仪（Bio-Rad），ChemiDocTMTouch成像系统（Bio-Rad），病理切片仪（Leica），A1R激光共聚焦显微镜（Nikon）。

1.2 实验方法

1.2.1 HE与Masson染色 经4%PFA溶液固定的小鼠肝组织，进行脱水及石蜡包埋，制成4 μm石蜡切片，于60 ℃烤箱烘烤后行二甲苯、梯度酒精脱蜡水化程序。用于HE染色的切片，分别进行苏木素染细胞核、伊红染细胞浆，再经梯度乙醇及二甲苯脱水、透明，中性树胶封片后用于镜检。用于Masson染色的切片，根据Masson染色试剂盒操作步骤依次进行Weigert铁苏木素溶液、丽春红品红溶液以及苯胺蓝溶液染色，经过相应分化与洗涤，最后脱水、透明并封固后用于镜下观察，每组小鼠取10个高倍视野（×400），进行Ishak纤维化评分分析［10］。

1.2.2 Western blot检测 取2年龄小鼠肝组织，采用蛋白提取试剂盒提取各组小鼠肝组织全蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度，然后加入5×SDS PAGE上样缓冲液混合，于100 ℃加热5 min。取30 μg总蛋白上样，经10%SDS PAGE电泳后，电转至PVDF膜，利用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h，加入相应的一抗（NDUFA13 1∶300，内参为小鼠抗β-actin 单克隆抗体1∶7000），4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，加入相应二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀释），室温孵育1 h，TBST再次清洗3次后，滴加ECL显色剂，采用全自动化学发光成像分析系统进行检测、成像，并利用Image J软件对条带进行灰度值分析。

1.2.3 免疫荧光染色 取2年龄小鼠新鲜肝脏组织，经OCT快速冷冻包埋，在冰冻切片机中切成8 μm冰冻切片，切片迅速置于4%PFA溶液固定0.5 h。PBS洗涤3次，加山羊血清室温封闭1 h，甩干后滴加稀释好的一抗溶液（F4/80 1∶300，TGF-β1 1∶200，TNF-α 1∶300，IL-1β 1∶300），置于4 ℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤后，滴加相应二抗溶液，室温孵育1 h，再次PBS洗涤，滴加DAPI溶液染细胞核，最后洗涤并采用抗荧光淬灭封片剂封片，用于激光共聚焦检测成像。每组小鼠选取10个高倍视野（×400），进行平均荧光强度分析［11-13］。

1.2.4 免疫组化染色 2年龄小鼠肝组织石蜡切片经脱蜡水化后，采用0.01 mol/L pH6.0枸橼酸钠缓冲液微波加热修复15 min，室温冷却后经PBS洗涤，滴加3%H2O2溶液避光孵育20 min，再次洗涤后，加5%BSA溶液室温封闭30 min。轻轻甩干，然后滴加稀释好的一抗溶液（α-SMA1∶800，MMP-91∶400，TIMP-11∶400，Collagen-Ⅰ1∶400，Collagen-Ⅲ1∶600）于4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，滴加相应二抗溶液覆盖组织，室温孵育1 h，再次洗涤后，加新鲜配制的DAB显色液，镜下控制显色时间。最后脱水透明并封片，用于显微镜镜检。每组小鼠选取10个高倍视野（×400），结合阳性细胞百分比与着色强度进行免疫组化评分分析［11-13］。

1.2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 7.0 和SPSS 18.0软件进行统计分析，组间差异行配对t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NDUFA13fl/-小鼠肝组织损伤及肝纤维化表型

小鼠肝组织石蜡切片用于HE染色、Masson染色分析。图1 结果显示，相比同年龄对照小鼠，4 周龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织小叶结构不清，肝细胞胞核皱缩坏死，Masson染色未见明显的胶原纤维生成（图1A、C）；2年龄对照小鼠肝组织结构基本清晰，大部分肝细胞形态正常，少许细胞胞浆出现衰老性水样变性，而同年龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织肝小叶排列紊乱，中央静脉及汇管区域出现大量浅蓝色胶原沉积（P<0.001，图1B、C），大部分肝细胞发生肿胀坏死，且可见炎症细胞浸润。

图1 HE染色、Masson染色检测小鼠肝组织损伤及纤维化情况Fig.1 Pathological and fibrotic changes in liver tissues of the mice revealed by HE staining and Masson staining(Original magnification:×400).A:HE staining and Masson staining of 4-week-old mice liver tissues. B:HE staining and Masson staining of 2-year-old mice liver tissues. C:Ishak scores of Masson staining.***P<0.001 vs control.

2.2 NDUFA13fl/-小鼠肝组织中NDUFA13蛋白的表达情况

2年龄小鼠肝组织提取全蛋白，用于Western blot检测NDUFA13蛋白表达水平。图2结果显示，相比对照小鼠，NDUFA13fl/-小鼠肝组织中的NDUFA13蛋白表达明显减少（P<0.001，图2A、B）。

图2 NDUFA13fl/-小鼠肝组织NDUFA13蛋白表达检测Fig.2 NDUFA13 protein expression in the liver tissues detected by Western blotting.A:Western blots.B:Relative density of NDUFA13 expression.***P<0.001 vs control.

2.3 NDUFA13缺陷诱导巨噬细胞及炎症因子活化

2年龄小鼠肝组织用于免疫荧光检测，图3结果显示，与对照小鼠相比，NDUFA13fl/-小鼠肝组织中F4/80巨噬细胞浸润明显增多，伴随TGF-β1 分泌显著增加（P<0.001，图3A）；且TNF-α与IL-1β炎症因子的表达也明显增强（P<0.001，图3B）。

图3 NDUFA13缺陷诱导巨噬细胞及炎症因子活化Fig.3 NDUFA13 loss promotes activation of macrophages and inflammatory cytokines(Original magnification:×400).A:F4/80 and TGF-β1 expression in control and NDUFA13fl/-mice detected by immunofluorescence assay.B:TNF-α and IL-1β expressions in control and NDUFA13fl/-mice detected by immunofluorescence assay.***P<0.001 vs control.

2.4 NDUFA13缺陷诱导纤维化相关因子激活

2.4.1 肝星状细胞活化标志物α-SMA检测 2年龄小鼠肝组织用于免疫组化检测，结果显示对照小鼠肝脏组织未见明显的α-SMA阳性表达，而NDUFA13fl/-小鼠肝脏肝小叶内可见明显的胞浆棕褐色颗粒沉积，α-SMA阳性细胞显著增加（P<0.001，图4A、B）。

2.4.2 肝脏组织MMP-9、TIMP-1检测 2年龄小鼠肝组织用于免疫组化检测（图5），对照组小鼠肝组织可见散在的棕褐色颗粒MMP-9 表达，而NDUFA13fl/-小鼠肝组织MMP-9的表达明显减少（P<0.001，图5A、B）；对照组小鼠肝组织中仅见少许TIMP-1阳性分布，而NDUFA13fl/-小鼠肝组织TIMP-1表达显著增强（P<0.001，图5A、C）。

2.4.3 肝脏组织胶原纤维Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ检测2年龄小鼠肝组织用于免疫组化检测，对照组小鼠肝组织未见明显的胶原沉积，而NDUFA13fl/-小鼠肝脏汇管区、中央静脉区及肝小叶内均有大量棕褐色聚集，Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表达显著增加（P<0.001，图6A～C）。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化甚至肝癌转变的必经病理路径，能否在此阶段阻遏或逆转纤维化进程，是慢性肝疾病防控的难点与重点［14-15］。目前，有关肝纤维化的细胞与分子机制成为研究的热点，包括肌成纤维细胞激活、炎症信号转导、细胞自噬与衰老及细胞器功能失调等［16-17］。其中，线粒体作为细胞能量代谢和氧化应激调节的关键场所，其结构或功能的紊乱是多种急慢性肝病的重要病理特征，如线粒体肿胀、氧化磷酸化功能减弱及活性氧异常释放等［17］，引起肝细胞代谢障碍和炎症激活［15］。此外，线粒体应激和损伤还可通过钙离子释放、融合与分裂动力学改变以及介导胞内信号转导等方式，调节肝脏细胞的自我更新、增殖与凋亡等过程［15］。探寻改善线粒体结构与功能稳态的治疗药物或靶点，可能是缓解肝炎与肝纤维化疾病的有效途径［14,18］。

图4 NDUFA13缺陷诱导肝星状细胞α-SMA激活Fig.4 NDUFA13 deficiency induces α-SMA activation in hepatic stellate cells (× 400). A:α-SMA expression in control and NDUFA13fl/-mice revealed by IHC staining.B:Statistical analysis of α-SMAin control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

图5 NDUFA13缺陷诱导MMP-9/TIMP-1表达失衡Fig.5 NDUFA13 inactivation results in abnormal MMP-9 and TIMP-1 expression(×400).A:MMP-9 and TIMP-1 expression in Control and NDUFA13fl/- mice analyzed by IHC staining. B, C:Statistical analysis of MMP-9 and TIMP-1 in control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

NDUFA13作为一种线粒体呼吸链组分蛋白，对小鼠器官发育极其重要。有文献报道NDUFA13基因整体敲除可导致小鼠胚胎死亡［19］，而我们实验发现NDUFA13 纯合敲除的小鼠几乎无法存活，这提示NDUFA13 蛋白在肝脏发育中的重要作用。近期NDUFA13作为一种新型的抑癌基因而备受关注，在多种恶性肿瘤中表达紊乱［7］。最新研究发现，NDUFA13蛋白可抑制STAT3信号介导的炎症反应而减轻DSS诱导的结肠炎［20］，并可抑制类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和侵袭［21］，在炎症调控中发挥重要作用。课题组前期揭示了NDUFA13在慢性萎缩性胃炎病理进程中表达渐进性下调的特点［6］，后续我们证实了NDUFA13失活可通过激活ROS/NF-κB/NLRP3炎症通路，募集炎症细胞并分泌炎症因子，从而诱导小鼠自发性肝炎［7］。本研究进一步探讨了肝细胞NDUFA13缺陷在诱导小鼠自发性肝纤维化中的作用及初步机制，发现NDUFA13缺失可诱导巨噬细胞活化并分泌TGF-β1等促纤维化炎性因子，进而激活HSCs，导致胶原沉积而促成肝纤维化。

图6 NDUFA13缺陷诱导胶原纤维沉积Fig.6 NDUFA13 inactivation causes collagen deposition in the liver(×400).A:Collagen-I and collagen-III expression in control and NDUFA13fl/- mice analyzed by IHC staining. B, C:Statistical analysis of collagen-I and collagen-III in control and NDUFA13fl/-mice.***P<0.001 vs control.

细胞外基质（ECM）的过度沉积是慢性肝损伤发生纤维化转变的直接原因，而HSCs作为胶原纤维的主要生产者，其增殖与活化是肝纤维化病理的核心环节［16］。多种炎症和纤维化相关的信号通路均可激活HSCs［16］。其中，转化生长因子TGF-β家族涉及各种纤维化疾病的发生发展过程［22］，能与多种信号分子如活性氧（ROS）、血小板源生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（cTGF）等相互作用，被认为是驱动HSCs活化与ECM沉积的关键因子［23］。作为研究最广泛的一类转化生长因子，TGF-β1主要由肝组织内Kupffer巨噬细胞表达和释放，通过激活Smad2/3信号通路诱导HSCs内Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ胶原转录［16］，还可介导脂质富集的肝细胞死亡［24］，并诱导肝细胞结缔组织生长因子产生［25］，促进肝纤维化发生。但鉴于TGF-β1广泛的生物学作用，其对肝纤维化及慢性肝病也存在其他多种调控机制与途径［23］。除了分泌TGF-β1等促纤维化因子，肝脏巨噬细胞也释放促肝细胞凋亡介质，募集炎症细胞并激活肌成纤维细胞［26］。此外，巨噬细胞还能促进HSCs的增殖与迁移［27］。我们的研究结果发现，NDUFA13表达缺失的小鼠肝组织中，巨噬细胞趋化聚集并分泌大量TGF-β1，刺激并激活静息HSCs转化为可分泌α-SMA的肌成纤维细胞。这提示NDUFA13缺陷可诱导肝脏巨噬细胞活化与TGF-β1释放，为HSCs的活化提供诱因。

炎症因子的分泌伴随慢性肝炎-肝纤维化病理的全过程，在纤维化的起始和延续中发挥重要作用。IL-1β与TNF-α作为强效炎症细胞因子，可由多种细胞分泌产生如巨噬细胞或活化HSCs 等。IL-1β在炎症小体NLRP3的作用下剪切成熟与释放，触发炎症反应，参与多种因素诱导的肝纤维化病理过程［27］。TNF-α可促进肝细胞凋亡、免疫细胞活化和抑制星状细胞凋亡。研究报道了NLRP3通过IL-1β、TNF-α等促炎因子的活化而诱导肝细胞损伤与肝纤维化［28-29］。此外，IL-1β、TNF-α均可上调基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1的表达，并介导巨噬细胞对星状细胞NF-κB信号的活化，但它们并不直接活化HSCs，而是通过促进活化星状细胞在体内外的存活而发挥作用［30］。结合我们前期的研究结果，NDUFA13失活诱导活性氧ROS异常释放而活化NF-κB/NLRP3炎症通路，引起IL-1β、TNF-α等炎症因子的分泌与释放，进一步促进HSCs增殖与活力，推动纤维化进程。

肝脏ECM的动态平衡主要由基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMPs/TIMPs）调节和维持。MMPs 可降解胶原蛋白，其活性受TIMPs 的抑制。在活化的HSCs中，MMPs/TIMPs 合成与分泌失衡，导致ECM降解减少而异常沉积，促进纤维化形成［28］。文献报道了纤维细胞因子TGF-β1 和炎性细胞因子IL-1β、TNF-α等均可调控MMPs/TIMPs蛋白的表达与活性［27,31］。这与我们的实验结果相一致，NDUFA13缺陷的小鼠肝脏中，活化的巨噬细胞分泌产生大量TGF-β1及IL-1β、TNF-α，通过影响MMP-9表达下调、TIMP-1表达上调，促进组织内Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ等胶原纤维的沉积，最终形成肝纤维化。

综上所述，小鼠肝脏NDUFA13缺陷可以诱导自发性的慢性肝纤维化病理表型，其可能机制为NDUFA13缺失诱导巨噬细胞活化并分泌TGF-β1及IL-1β、TNF-α等炎症相关因子，进一步激活HSCs 并扰乱MMPs/TIMPs平衡，促进Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ等胶原纤维的分泌与沉积。本研究立足于前期有关“小鼠肝脏NDUFA13失活通过调控ROS/NF-κB/NLRP3炎症通路诱导自发性肝炎病理进程”的研究［8］，进一步明确了NDUFA13在后续肝纤维化中的调控作用与初步机制，对慢性肝病及肝纤维化恶性进展的早期防治具有重要意义，并为慢性肝炎-肝纤维化相关药物或机制研究提供一种有利的动物模型。后续我们将采用诱导型敲除小鼠模型，实现在小鼠出生后的肝脏特异性敲除，获得NDUFA13 杂合和纯合敲除小鼠，继而深入探究NDUFA13缺陷活化肝星状细胞的具体分子机制，揭示其相关区域的免疫学特征。