结肠癌中Nup107的表达与临床病理特征及预后的关系

金 秋，石永利，林 波，王海啸，张 晓，季润元*

（1江苏护理职业学院医学基础部，江苏 淮安 223005；2南京医科大学附属淮安第一医院病理科，3胃肠外科，江苏 淮安 223300；4南京医科大学国家卫生健康委抗体技术重点实验室，江苏 南京 211166）

结肠癌是全球第三常见的恶性肿瘤，2018年新增病例109.6万并导致50万患者死亡［1］。手术切除和放化疗是早期结肠癌的有效治疗手段，但对晚期结肠癌患者效果不佳，由于发病隐匿，超过半数的患者确诊时已为中晚期［2］。因此，应加大对结肠癌癌变关键调控因子的识别，确定新的诊断标志物和治疗靶点，最终提高结肠癌的治疗效果。

核孔蛋白（nucleoporin，Nup）是核孔复合物（nuclear porecomplexes，NPC）的主要成分，它能够调节细胞质和细胞核之间的信号转导［3］。Nup在许多类型的癌症，如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中过表达，这表明它们可能参与了肿瘤的发生［4］。Nup107是Nup107亚复合物的关键组成部分，位于NPC的中心支架上，是NPC组装和mRNA输出的关键。目前关于Nup107在结肠癌中表达与预后的研究较少。

本研究检测Nup107在结肠癌组织中的表达，并证明其与结肠癌患者临床病理特征及预后的关系，为结肠癌的诊断、预后和靶向治疗提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象

所有参与研究的结肠癌患者于2012年12月—2016年5月在南京医科大学附属淮安第一医院接受活检或手术，共226例。患者年龄32～76岁，平均年龄53岁。手术前患者均未接受化疗或放疗。另选取38例正常结肠组织作为对照。纳入研究的患者临床病理资料包括性别、年龄、肿瘤位置、组织学类型、分化、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、美国癌症协会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期、Ki67表达。本研究获得了南京医科大学伦理委员会的批准和患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 Ualcan检索

Ualcan（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个有效的癌症数据在线分析和挖掘的网站，主要是基于TCGA数据库中的相关癌症数据进行分析。本研究分析比较了41例正常结肠组织和286例结肠癌组织的mRNA表达情况。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）

使用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒（Invitrogen公司，美国）从19对新鲜结肠癌和癌旁正常组织中提取总RNA。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Thermo公司，美国）将RNA逆转录为cDNA。使用Power SYBR Green PCR预混液（Applied Biosystems公司，美国）在QuantStudio 5实时PCR系统上进行扩增。实验中使用的引物序列如下：Nup107上游5′-CACGGACTGCACGGAAACA-3，下游5′-GAGTTCGAGGGATAACCTGGT-3′；GAPDH上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游5′-AAGTGGTCGTT GAGGGCAATG-3′。以GAPDH为内参照基因分析Nup107 mRNA表达，以2-ΔΔCt计算Nup107相对表达量。以上实验重复2次。

1.2.3 组织芯片（tissue microarray，TMA）制作

所有组织标本均在4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋。提前观察结肠组织蜡块，确定典型组织位置。利用TMAGrand Master（3DHISTECH，匈牙利）从供体蜡块中钻取核心组织柱，直径1.5 mm，然后包埋于受体块中。将受体块切成厚度为3 μm的切片，置于含聚赖氨酸涂层的玻片上。

1.2.4 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色

采用SP法对结肠TMA样本进行IHC染色，具体步骤见Histostain SP免疫组化染色试剂盒说明书。一抗为兔抗人Nup107多克隆抗体（Abcam公司，英国），稀释比例1∶200。IHC结果由2名病理医师在双盲情况下进行评估。结肠组织中细胞的Nup107染色强度被评为0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（中阳性）、3分（强阳性）。组织最终染色得分=（3×强染色细胞百分比+2×中度染色细胞百分比+1×弱染色细胞百分比）×100，最终染色评分范围0～300。根据结肠癌患者的生存预后情况，使用X-tile软件将Nup107表达情况分为高表达和低或无表达，计算出截断值为115。

1.2.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

检索TCGA数据库，获取结肠癌患者转录组测序数据。使用GSEA v2.2.2软件进行分析。根据Nup107 mRNA中位表达水平将样本分为高表达组和低表达组进行比较，根据分子标签数据库中的KEGG基因集定义功能基因集。P＜0.05且FDR＞0.25为有统计学意义。

1.3 统计学方法

所有数据均在SPSS 18.0软件上进行分析。计量资料以均值±标准差（）表示，采用成组t检验比较两独立研究组间均数。对例数和率的比较采用Pearsonχ2检验，计算Nup107与临床病理特征的相关性。采用Kaplan-Meier法分析累计生存率。建立Cox比例风险回归模型，先进行单因素分析，对P＜0.01的组别再进行多因素分析，确定预后因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nup107 mRNA在结肠癌组织中高表达

通过检索Ualcan数据库，比较了41例正常结肠组织和286例结肠癌组织中Nup107 mRNA的表达水平，发现Nup107 mRNA在结肠癌中的表达显著高于正常肠黏膜组织（P＜0.05，图1A）。通过qRTPCR检测17对结肠癌组织和正常结肠组织的Nup107表达，验证了Nup107在结肠癌组织中高表达（P＜0.05，图1B）。

2.2 Nup107蛋白在结肠癌组织中高表达

IHC结果显示，Nup107蛋白定位于细胞核膜，在结肠癌细胞中高表达（图2）。在结肠癌组织中，Nup107高表达率为65.93%（149/226），高于正常结肠黏膜组织（42.11%，16/38），差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3 结肠癌中Nup107表达水平与临床病理特征的关系

图1 Nup107 mRNA在结肠组织中的表达情况Figure 1 Expression of Nup107 mRNA in colon tissue

图2 结肠组织中Nup107表达的免疫组化染色Figure 2 IHC staining for Nup107 expression in colon samples

表1 Nup107蛋白在结肠组织中的表达Table 1 Expression of Nup107 protein in colon tissues

通过收集226例结肠癌患者的临床资料，分析Nup107表达水平和患者临床病理特征之间的关系（表2）。结果表明，Nup107表达与肿瘤大小（χ2=13.188，P=0.004）、淋巴结转移（χ2=12.080，P=0.002）、远处转移（χ2=7.167，P=0.007）、AJCC分期（χ2=14.135，P=0.003）和Ki67表达（χ2=10.683，P=0.001）显著相关，而与性别、年龄、组织学类型或分化程度无相关性。

2.4 结肠癌中Nup107表达水平与患者预后的关系

使用单因素和多因素Cox回归分析确定结肠癌的预后因素。单因素分析中Nup107表达（HR：1.891，95%CI：1.627～2.250，P＜0.001）、远处转移（HR：2.124，95%CI：1.942～2.307，P＜0.001）、AJCC分期（HR：1.227，95%CI：1.112～1.436，P＜0.001）和Ki67表达（HR：0.673，95%CI：0.582～0.706，P＜0.001）与总生存期相关（表3）。多因素分析中，Nup107表达（HR：1.492，95%CI：1.179～1.845，P＜0.001）、远处转移（HR：2.283，95%CI：1.679～2.872，P＜0.001）和AJCC分期（HR：1.201，95%CI：1.145～1.384，P＜0.001）是结肠癌患者预后的独立风险因素（表3）。Kaplan-Meier生存分析证实，Nup107高表达结肠癌患者的生存时间明显短于Nup107低表达患者（图3）。

表2 Nup107表达与结肠癌患者临床病理特征的关系Table 2 Relationships between Nup107 expression level and clinicopathological characteristics of patients with colon cancer

2.5 基于Nup107高表达的基因富集分析

自TCGA数据库下载结肠癌患者的RNA-seq数据，并分析Nup107高表达结肠癌患者组织中基因富集的通路。结果显示，Nup107高表达的结肠癌组织中基因富集于基础转录因子、错配修复、同源重组、核糖体、剪接体、RNA降解等途径（表4）。

3 讨论

NPC由约30种不同的Nup组成，是细胞核和细胞质之间大分子交换的唯一通道［5］。NPC由Nup93复合物、Nup107/Nup160复合物和Nup62复合物3部分组成［6］。越来越多的证据表明，NPC与肿瘤发生密切相关。Tpr是第1个被确认参与肿瘤发生的Nup，其在人类结直肠肿瘤中表达降低［7］。Nup98在小鼠和人肝癌中表达下降，并通过调控p53靶基因发挥潜在的抑癌作用［8］。Nup88在结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌等肿瘤中过表达［9］。在鳞状细胞癌中，Nup62高表达且升高，通过调控p63核转运调控细胞活动［10］。POM121在结肠癌中高表达，并能促进前列腺癌细胞的侵袭性和耐药性［11-12］。由此可见，不同Nup在肿瘤中发挥着促癌或抑癌的作用。

Nup107是Nup160/Nup107亚复合结构的重要组成部分，是NPC组装的关键，并参与信号调节分子的易位［13］。在DNA损伤诱导的基因毒性应激中，Nup107能够介导凋亡蛋白酶激活因子1的核转位［14］。Nup107的缺失导致真核细胞凋亡，且干扰Nup107表达可使衰老细胞的生长因子信号通路减弱［13，15］。Nup107与鼻咽癌细胞间期和有丝分裂期的NPC生成有关，并调控着丝点处的微管聚合［16-17］。Nup107单核苷酸变异极可能与卵巢癌患者化疗敏感性有关［18］。这些发现提示Nup107在肿瘤组织中是一个重要的调节因子。

本研究首先通过Ualcan数据库和qRT-PCR证明了Nup107在结肠癌组织中的mRNA水平高于正常肠黏膜组织，随后对38例正常结肠组织和226例结肠癌组织进行IHC染色，发现结肠癌组织的Nup107高表达率（65.93%）高于正常结肠组织（42.11%），与其在宫颈癌组织中的表达趋势一致［19］。分析Nup107表达水平和结肠癌患者临床病例特征的相关性，发现Nup107高表达与较大肿瘤体积、发生淋巴结转移、远处转移、较差AJCC分期和Ki67表达阳性有关，表明Nup107可能促进了结肠癌细胞的增殖和转移。单因素和多因素Cox回归分析证明Nup107表达是结肠癌患者预后的风险因素，Kaplan-Meier生存曲线也显示Nup107高表达结肠癌患者总体生存率低于Nup107低表达患者。以上结果表明，Nup107可能成为结肠癌新的预后标志物。

目前Nup107在结肠癌发生发展中的作用机制尚不清楚，本研究通过对TCGA数据库结肠癌患者RNA-seq信息进行GSEA，发现相较于Nup107低表达结肠癌组织，Nup107高表达的结肠癌组织中基因富集于基础转录因子、错配修复、同源重组、剪接体、RNA降解、核苷酸切除修复、细胞周期、DNA复制等途径。转录因子参与了大量的人类疾病，约占目前为止发现的所有致癌基因的20%［20］。Nup107对肿瘤相关转录因子的调节可能是肿瘤发生的一大诱因。Nup107对错配修复、同源重组、核苷酸切除修复、DNA复制的影响表明Nup107可能通过调控DNA损伤修复促进结肠癌的发生［21］。此外，GSEA结果表明Nup107可能通过干预细胞周期调控结肠肿瘤的生长增殖。

表3 单因素和多因素Cox回归分析结肠癌患者总生存期的预后因素Table 3 Univariate and multivariable Cox regression analysis of prognostic factors for overall survival in patients with colon cancer

图3 结肠癌患者的Kaplan-Meier生存曲线Figure 3 Survival curves of patients with colon cancer using the Kaplan-Meier plots

表4 Nup107高表达的结肠癌患者的基因通路富集分析Table 4 GSEA of colon cancer patients with high Nup107 expression

综上所述，Nup107在结肠癌组织中高表达，且Nup107高表达与结肠癌患者预后不良相关。Nup107有可能成为结肠癌患者新的预后标志物和治疗靶点，但其在结肠癌中的作用和机制仍需进一步研究。