电针环跳、阳陵泉对CCI大鼠海马18F-FDG摄入率及GLUT-3表达的影响

江孟鸿，张亮平，李长征，王志福，郑美凤*

（1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122）

神经病理性疼痛（简称神经痛）是躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛［1］。目前研究发现：在神经痛发生发展的过程中，海马出现了结构和功能的改变，如体积减小、突触可塑性和细胞因子释放的异常等［2-5］。正电子发射型计算机断层扫描显像仪（positron emission tomography，PET）可通过对18F-氟代脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）的追踪，动态观察海马的葡萄糖代谢变化。葡萄糖转运体-3（Glucose transporter 3，GLUT-3）是大脑主要的葡萄糖转运体之一，能有效反映海马神经元的葡萄糖代谢情况［6］。现代研究表明：取“环跳”“阳陵泉”穴进行电针干预有明确镇痛作用，但电针镇痛的中枢葡萄糖代谢机制有待进一步研究［7-9］。本研究通过建立SD大鼠慢性限制性损伤（chronic constriction injury，CCI）模型，采用Micro PET／CT和免疫组化分别检测CCI大鼠海马18F-FDG摄入率和GLUT-3表达，探讨电针治疗神经痛的中枢作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 SPF级雄性SD大鼠36只，体质量180～200 g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心，合格证编号：SYXK（闽）2014-0005。于独立通风笼内适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、电针组，每组各12只。

1.2 主要仪器与试剂 Micro PET／SPECT／CT（荷兰Milabs公司）；Von-Frey针刺痛觉测试套件（美国North Medical公司）；华佗牌针灸针（0.25 mm×25 mm）、华佗牌电子针疗仪（SDZ-V型）购于苏州医疗用品厂有限公司；免疫组化一抗GLUT-3抗体、免疫组化二抗HRP标记兔抗山羊（美国Abcam公司）；免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 造模 参考Bennett等推荐的方法［10］制备CCI模型，具体方法如下：术前将4-0铬制羊肠线浸泡在0.9%氯化钠注射液1 h以上；3组大鼠称重，予戊巴比妥钠麻醉，剃除右后肢毛发，75%乙醇消毒并切开皮肤，逐层钝性分离皮下组织及肌肉，暴露坐骨神经主干；模型组和电针组大鼠在坐骨神经主干中段用4-0铬制羊肠线松扎四道，最后一道结扎时，轻拉线结使腿部肌肉出现轻微跳动，然后逐层缝合，切口覆盖青霉素粉末以预防感染。假手术组只暴露坐骨神经，不予结扎。

1.4 干预措施 术后7 d电针组开始电针干预。抓取电针组大鼠，固定于实验用大鼠固定器，参照《实验针灸学》［11］取右侧“环跳”“阳陵泉”穴，以针灸针常规刺入15 mm，连接电子针疗仪，设置连续波，频率为2 Hz，电流强度为1 mA，每次干预30 min。同样抓取和固定假手术组、模型组大鼠，但不予干预，每天1次，连续7 d。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 机械痛阈值测试 术前及干预前后采用Von-Frey针刺痛觉测试套件检测，根据up-and-down的方法［12］进行测试与计算大鼠机械痛阈值。

1.5.218F-FDG摄入率检测 干预前后每组随机取6只大鼠进行Micro PET／CT扫描。大鼠禁食过夜后，腹腔注射示踪剂18F-FDG（剂量约40 MBq）后再放回笼中自由活动35 min，然后置于麻醉诱导盒中5 min（5%异氟烷，气流速度400 mL／min）。取出大鼠以俯卧位用胶布固定于扫描台，开始扫描并全程维持麻醉（2%异氟烷，气流速度250 mL／min）。扫描图像通过PMOD软件分析，得出大鼠左侧海马18F-FDG摄入率。

1.5.3 GLUT-3表达的测定 采用免疫组化测定GLUT-3平均光密度，来反映GLUT-3的表达。干预后各组取剩余的6只大鼠，腹腔麻醉后依次用0.9%氯化钠溶液（150 mL）和4%多聚甲醛溶液（150 mL）进行心内灌注；取出大脑，放入4%多聚甲醛再固定后常规脱水、透明、包埋；切片（5μm）后烤片、脱蜡，浸泡在柠檬酸钠溶液下使用高压锅法进行修复，滴加3%双氧水溶液于室温下孵育25 min，PBS清洗后滴加3%BSA于37℃恒温箱内放置30 min，取出切片，甩干后滴加免疫组化一抗GLUT-3抗体（1∶50），放入4℃冰箱孵育过夜；第二天取出切片，复温30 min后滴加免疫组化二抗HRP标记兔抗山羊后放入37℃恒温箱内孵育1 h；滴加新鲜配置的DAB溶液进行显色，PBS清洗后用苏木精复染，二甲苯脱水透明，封片。光学显微镜下参照《大鼠脑立体定位图谱》［13］找到左侧海马所处位置，随机选取5个部位进行图像采集，通过Image-Pro Plus 6.0软件分析图像并得出GLUT-3平均光密度。

1.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，自身前后对照采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。若方差齐，采用LSD法进行各组间两两比较；若方差不齐，则采用Game’S-Howell法进行两两比较。

2 结 果

2.1 3组大鼠机械痛阈值比较 干预前与假手术组比较，模型组和电针组大鼠机械痛阈值均显著降低（P均＜0.01）；干预后与模型组比较，电针组大鼠机械痛阈值显著升高（P＜0.01）；干预后与干预前比较，电针组大鼠机械痛阈值显著升高（P＜0.01），见表1。

表1 3组大鼠机械痛阈值比较（±s）g

表1 3组大鼠机械痛阈值比较（±s）g

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与干预前比较，3）P＜0.01。

?

2.2 3组大鼠18F-FDG摄入率比较 干预前与假手术组比较，模型组和电针组大鼠左侧海马18F-FDG摄入率显著下降（P＜0.05）；干预后与模型组比较，电针组大鼠左侧海马18F-FDG摄入率显著上调（P＜0.05）；与干预前比较，干预后电针组大鼠18FFDG摄入率显著提高（P＜0.05），见图1。

图1 3组大鼠18F-FDG摄入率比较

2.3 3组大鼠GLUT-3平均光密度比较 干预后与假手术组比较，模型组大鼠左侧海马GLUT-3平均光密度显著降低（P＜0.01）；干预后与模型组比较，电针组大鼠左侧海马GLUT-3平均光密度显著升高（P＜0.01），见图2。

图2 3组大鼠GLUT-3平均光密度比较

3 讨 论

坐骨神经痛属中医学“痛痹”范畴，多因感受风寒湿外邪、气血痹阻经脉所致。针灸治疗坐骨神经痛的一般原则为疏经通络、活血止痛。本实验选取“环跳”穴疏导下肢少阳、太阳经气，“阳陵泉”治疗下肢经筋病证。现代研究证明：电针此二穴可通过调节神经递质、细胞因子和突触功能来提高神经痛大鼠的机械痛阈值［14-16］。

18F-FDG摄入率的改变能直观反映葡萄糖代谢的变化，而GLUT-3的表达水平与局部葡萄糖利用、神经元的功能活动密切相关。本研究结果发现：CCI诱导神经痛发生时，海马葡萄糖代谢和GLUT-3平均光密度降低，提示海马中枢敏化和痛敏反应的产生。而电针治疗后可上调神经痛大鼠海马葡萄糖代谢及GLUT-3表达水平，说明电针治疗可抑制海马中枢敏化、减轻痛敏反应。