黑大蒜多糖对X射线辐射损伤小鼠的防护作用

胡 淼 ，徐鸿洁，常哲兴

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

随着科技的高速发展，人工电离辐射已遍及科研、医疗、核能、农业和工业等部门，在接触过程中若防护不当，可造成免疫、造血、神经、消化、生殖等全身多个器官系统的损害.而肿瘤患者在接受放射治疗的过程中，除有效杀伤敏感的恶性肿瘤细胞外，也会杀伤正常细胞，特别是处于持续增殖分裂状态的细胞，从而对机体造成一系列损害.人体自身的辐射损伤修复能力有限[1-2]，因此，从天然产物中开发安全、有效的具有抗电离辐射作用的食品和药物具有一定的研究价值.黑大蒜是天然大蒜的发酵制品，取新鲜生蒜，保留外皮，在发酵箱内经过2～3个月的高温、高湿发酵制成，因成品呈现特有的黑褐或棕褐色而得名.发酵后，黑大蒜的营养成分和生物活性发生了显著改变，特别是总糖含量较生大蒜提高近7倍，并且以多聚糖为主.研究[3-4]发现：黑大蒜多糖具有抗炎、杀菌、抗氧化、增强免疫力、血糖调节等多种功效，但有关黑大蒜多糖的辐射防护作用未见报道.本研究通过X射线照射建立小鼠辐射损伤模型，观察黑大蒜多糖对辐射导致的小鼠免疫器官、血细胞、抗氧化酶系统的影响，以期为辐射防护相关产品开发提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠(吉林大学白求恩医学部实验动物中心，许可证号：SCXK-吉2013-0005)75只，雄性，8～12周龄，体质量20～24 g.实验室通风，室温18～22 ℃条件下，小鼠适应性喂养1周后进行实验，期间摄食和饮水自由.

1.2 材料和试剂

黑大蒜(山东省万兴食品有限公司)；黑大蒜多糖(Black garlic polysaccharide，BGP)由吉林医药学院预防医学实验中心采用水提醇沉法提取，提取物平均多糖含量为7.03 mg/g[2].蛋白含量和抗氧化活性应用T-SOD、LDH、T-AOC、GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定.

1.3 主要仪器和设备

SN6308型直线加速器(Varian Trilogy公司，美国)；722可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；C0036-HK型低温冷冻离心机(赫曼公司，德国)；LH750型全自动血细胞分析仪(Beckman Coulter公司，美国)；Model 680型酶标仪(伯乐公司，美国)；CX31型光学显微镜(OLYMPUS株式会社，日本).

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组及处理

将已适应环境的小鼠按照体质量随机分为5组，包括空白对照组(NC)、辐射模型组(M)、黑大蒜多糖低(BGP-L)、中(BGP-M)、高剂量组(BGP-H)，每组15只.小鼠于辐射前进行预防性给药，实验组以黑大蒜多糖提取物灌胃，低、中、高剂量组分别为150、300、600 mg/kg，灌胃总体积为2 mL，空白对照和辐射模型组灌胃等体积生理盐水.每日上午固定时间灌胃，每3 d称取一次动物体质量，连续给药14 d，15 d后对辐射模型组和黑大蒜多糖各剂量组小鼠进行全身X射线照射，源皮距为100 cm，照射野为20 cm×20 cm，辐射剂量率为400 cGy/min，照射时间为28.5 s，2 Gy/d，连续照射2 d，小鼠辐射总吸收剂量为4 Gy.空白对照组在相同条件下给予假照射，末次辐射后2 d处死动物，立即进行指标检测.

1.4.2 免疫器官指数和内源性脾结节测定

小鼠眼底静脉丛取血后脱臼处死，分别取出胸腺和脾脏组织并称重，计算胸腺指数和脾脏指数[脏器指数=(被测脏器质量/小鼠体质量)×100%].内源性脾结节(CFU-S)测定：取称重后脾脏，浸入Bouin氏固定液中16 h，取出后用75%乙醇洗涤，于放大镜下观察脾脏表面结节并计数[5].

1.4.3 血常规检测

小鼠眼球取血，血液直接滴入加入肝素抗凝的EP管中，轻轻摇动，使其充分混匀；应用全自动血细胞分析仪进行血常规检测，测定指标为红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血小板数(PLT)和血红蛋白(HGB)含量.

1.4.4 肝脏组织中抗氧化相关酶活性测定

取小鼠肝脏组织，于预冷的0.9%生理盐水中漂洗，去除血污，滤纸吸干水分，称重，置于研钵中，加入一定体积的PBS缓冲液，通入少量液氮，迅速用钵杵进行研磨[6].将研磨后的组织匀浆液移入10 mL离心管中，补充PBS缓冲液，制成10%肝匀浆.2 000 r/min离心15 min，弃沉淀，将上清液移入新的离心管中待测.按照试剂盒操作要求，采用考马斯亮蓝法测定肝脏组织蛋白含量，羟胺法测定T-SOD活性，比色法测定LDH和T-AOC活性，分光光度法测定GSH含量.

1.4.5 骨髓微核实验

取小鼠胸骨，剔除表面肌肉组织，生理盐水清洗，滤纸吸干水分；剪去骨骺端，用弯头镊子将骨髓液挤出，滴于已预先加入1滴小牛血清的载玻片一端；另取一块清洁载玻片，在血清上轻轻滑动，使骨髓液与血清充分混合；45°快速推片，形成2～3 cm骨髓涂片，空气中自然晾干.将骨髓片置于染色缸中甲醛固定15 min，取出晾干.平放骨髓片，滴加新鲜配制的姬姆萨A应用液，将玻片上骨髓涂片部分完全覆盖，1 min后，在已铺好的姬姆萨A液上方，滴加姬姆萨B应用液，用胶头滴管小心反复吹吸染液，使其充分混合，染色15 min，使用磷酸盐缓冲液冲洗玻片，晾干保存备用[7].先在低倍镜下选择染色及视野较好区域，之后更换油镜观察计数.每张玻片计数前，需保证该片中嗜多染红细胞(PCE)与正常红细胞的比值在0.6～1.2之间.计数1 000个PCE中含微核的细胞数量(单个PCE细胞中出现的≥1个微核，均按1个微核细胞计数).微核率=(含微核PCE细胞数/观察PCE细胞总数)×1000‰.

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 BGP对辐射损伤小鼠免疫器官指数和CFU-S计数的影响

与对照组比较，辐射模型组和BGP150、300、600 mg/kg剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均明显降低，CFU-S数明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明辐射对小鼠的造血和免疫器官造成了急性损伤；与辐射模型组比较，黑大蒜多糖600 mg/kg剂量组胸腺指数和脾脏指数明显增高，150、300、600 mg/kg剂量组CFU-S数明显增加(P<0.05).见表1.

2.2 BGP对辐射损伤小鼠血常规的影响

与对照组比较，辐射模型组小鼠WBC计数和PLT计数均显著降低(P<0.05)，说明辐射抑制了造血功能，导致外周血细胞的迅速减少；与辐射模型组比较，黑大蒜多糖300 mg/kg剂量组WBC计数明显升高，600 mg/kg剂量组PLT计数明显升高(P<0.05)；黑大蒜多糖150、300、600 mg/kg剂量组的RBC计数和HGB含量与对照组和模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05).见表2.

表1 BGP对辐射损伤小鼠胸腺指数、脾脏指数和CFU-S计数的影响

表2 BGP对辐射损伤小鼠血常规的影响

2.3 BGP对辐射损伤小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响

与对照组比较，辐射模型组小鼠T-SOD、LDH、T-AOC活力和GSH含量均明显降低(P<0.05)，说明X线辐射抑制了小鼠体内抗氧化酶活性和部分还原性物质的含量，引起小鼠的急性氧化损伤；与辐射模型组比较，黑大蒜多糖150、300、600 mg/kg剂量组T-SOD活力和GSH含量均显著升高，600 mg/kg剂量组LDH、T-AOC活力明显升高(P<0.05).见表3.

表3 BGP对辐射损伤小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响

2.4 BGP对辐射损伤小鼠骨髓PCE细胞微核率的影响

与对照组比较，辐射模型组小鼠骨髓微核率显著增加(P<0.05)，说明辐射诱导了染色体损伤；与辐射模型组比较，黑大蒜多糖150、300、600 mg/kg剂量组骨髓微核率明显下降(P<0.05).见表4.

表4 BGP对辐射损伤小鼠骨髓PCE细胞微核率的影响

3 讨 论

从天然植物中寻求安全、有效的抗辐射功能成分，是近年来辐射防护领域研究的热点.有研究[8-9]报道了植物多糖的抗辐射功能，丁妍等[10]研究发现，灵芝多糖可显著提高受60Coγ照射小鼠的生存率和外周血WBC数；王宏芳等[5]研究了松茸多糖对辐射损伤小鼠造血功能的影响，发现松茸多糖可降低造血基质细胞的辐射敏感性，从而促进受辐射后小鼠造血功能恢复.在本研究团队的前期工作中，我们采用水提醇沉法从黑大蒜中提取了粗多糖，并进行了提取工艺优化和黑蒜多糖的体内抗氧化、抗疲劳实验[2]，发现黑大蒜多糖具有较好的抗氧化活性.当电离辐射穿透生物体细胞时，会造成细胞内分子的多次电离，并与水分子和氧发生复杂的相互作用，形成大量的活性氧自由基和过氧化物自由基，造成细胞氧化损伤，从而出现辐射生物学效应[9].黑大蒜多糖较好的抗氧化活性能否对实验动物的辐射损伤产生修复作用，是我们开展本次研究的目的.

胸腺组织和脾脏组织是机体重要的造血器官和免疫器官，因细胞增殖旺盛而对电离辐射非常敏感[12-13].当实验动物受到射线照射后，会出现胸腺和脾脏的萎缩，但在脾脏表面可出现内源性脾结节(CFU-S)，它代表脾集落形成单位，属一种多向性造血细胞群，每个单一的脾结节由1个造血干细胞增殖分化产生[14].辐射后骨髓造血干细胞因细胞凋亡而数量骤减，特别是骨髓中的幼稚造血干细胞受损严重，血细胞失去再生来源，表现为全血WBC计数和PLT计数的降低.少量残存的尚具有增殖能力的干细胞会被迫迁移至脾脏而形成集落，因此，内源性脾结节的数量可间接反映造血功能的恢复情况.本研究发现：辐射模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著降低，CFU-S数增高，血液中WBC计数和PLT计数显著下降，黑大蒜多糖可使辐射损伤小鼠的胸腺和脾脏指数增加，WBC计数和PLT计数明显升高，CFU-S数进一步提高，推断其可能通过降低造血器官和免疫器官对辐射的敏感性、减轻辐射后骨髓造血干细胞的应激反应和功能抑制、减少造血干细胞凋亡、提高应激状态下造血代偿器官脾脏的血细胞增殖能力而发挥作用.

生物体受到电离辐射后，会产生大量的活性氧和自由基，它们一方面可攻击蛋白质、核酸等生物大分子，造成辐射生物学效应；另一方面，还会通过脂质过氧化而引起生物膜结构和成分的改变，从而加重细胞氧化损伤[11].本研究发现：辐射模型组小鼠肝脏组织中T-SOD、LDH、T-AOC活力和GSH含量均明显降低，使用黑大蒜多糖后，有助于恢复辐射损伤小鼠肝脏组织中抗氧化酶T-SOD、LDH、T-AOC活力，提高抗氧化酶表达水平，同时还可促进抗氧化活性物质GSH的生成.电离辐射过程中产生的自由基有2/3可被酶类和非酶自由基清除剂清除，由于非酶自由基清除剂大多为外源性的营养物质，所以酶类自由基清除剂的活力水平可直接影响辐射损伤后抗氧化作用的发挥.因此，我们推测，黑大蒜多糖可通过提高机体酶类自由基清除剂活性、减少辐射后自由基生成数量、抑制脂质过氧化过程而起到防护辐射损伤的作用.

电离辐射可对细胞周期产生影响，特别是对S期细胞影响显著，可使该周期明显延长，抑制DNA合成[11].辐射还可造成染色体损伤，辐射后实验动物染色体可能因受损而产生断片，也可能因纺锤体受损而导致染色体整体丢失.当进入细胞分裂后期，这些断片或整条染色体会遗留于细胞质中，形成微核.微核实验常被用作外源性化学物或诱变剂、辐射损伤等导致的生物体遗传物质突变检测.本实验中，我们选用微核率推断X射线辐射对小鼠造成的遗传危害和染色体受损情况.结果显示：辐射模型组小鼠骨髓微核率明显升高，使用黑大蒜多糖进行预防性干预后，骨髓微核率呈现下降趋势，说明黑大蒜多糖能够抑制辐射诱导的遗传物质突变，减轻染色体损伤.

本研究结果显示：黑大蒜多糖可提高脾脏的代偿性造血增殖能力，提高机体抗氧化酶水平，抑制辐射诱导的遗传物质突变，具有较好的辐射防护作用，但更深入的细胞和分子机制还有待进一步研究.