甘草炭纳米类成分对应激性胃溃疡大鼠的保护作用研究

刘楚妤，刘育含，吴佳姝，赵亚芳，钟琪，孔慧，屈会化（.北京中医药大学中医学院，北京 00029；2.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 00029）

应激性胃溃疡（stress-induced gastric ulcer，SGU）是指机体在受到如休克、创伤、手术、危重疾病或严重心理疾病等强烈刺激后发生的以炎性糜烂、浅表溃疡及出血为特征的急性胃黏膜病变，其发病机制尚未完全清楚。

甘草在《神农本草经》中归为上品，2015年版《中国药典》记载甘草：“性味甘、平；归心、肺、脾、胃经”，具有补脾益气、缓急止痛、调和诸药的作用[1]。张仲景在《伤寒杂病论》中的260 个方剂中（重复方、异名方及附方未计入）共有125 方涉及甘草[2]。而在《伤寒论》中含甘草的 70 首方剂中应用炙甘草者多达68 首，可见炙甘草在配伍中的重要性。本团队在前期考证发现张仲景所用炙甘草并非蜜炙甘草而是炒甘草，其本质是将甘草部分碳化[3]，且已经在荆芥炭、麦芽炭、葛根炭、枳实炭、蒲黄炭等中药炭药中发现了纳米类成分，并证明这些纳米类成分具有较好的止血、降糖、镇痛、保肝、抗炎、降尿酸、增溶等效果[4-10]。同时也在甘草炭中发现了纳米类成分，并命名为GRRC-NCs，通过小鼠急性酒精性胃溃疡模型证明其具有抗溃疡作用[11]。本实验利用水浸拘束法制备大鼠SGU 模型，进一步探究GRRC-NCs 对SGU 的保护作用，为GRRC-NCs 的应用提供新思路。

1 材料

1.1 仪器

PXR-9 马弗炉（北京中科奥博科技有限公司）；PFT-100A 高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-1 水浴锅（金坛市画成开元实验仪器厂）；SA1245-CW 电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；84-1A 磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；DRP-9082 恒温孵育箱（上海森信实验仪器有限公司）；HC-2518R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；组织匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；Biotek 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 试药

生甘草（北京仟草中药饮片有限公司，产地新疆，批号：190711008）；生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：2008012003）；45-1000DRC膜透析袋（北京拜尔迪科技有限公司，批号：132640-2007）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99.5%，批号：20150508）；盐酸雷尼替丁（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：Y29D7C27738）；白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒、五羟色胺（5-HT）ELISA 试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；水为去离子水。

1.3 动物

SPF级雄性健康SD大鼠48只，体质量180 ～220 g [北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号：110324201103658567]。实验期间动物均饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF 级动物房内，保持空气湿度55%～65%，室温（24±1）℃，环境安静，动物随意进食饮水，明暗12 h 循环饲养。所有动物于实验前24 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 GRRC-NCs 制备

按照本实验团队前期研究确定的步骤烧制甘草炭并制备GRRC-NCs[11]。制备过程如下：称取600 g 甘草生药置于坩埚中，使用铝箔纸密封加盖于马弗炉中烧制。马弗炉程序升温：第一阶段5 min 升温至100℃，保温30 min；第二阶段25 min 升温至375℃，保温1 h。将烧制好的甘草炭置于中药粉碎机中粉碎。每次称取甘草炭粉末50 g，放于30 倍去离子水中用水浴锅加热两次，温度设置为100℃，时间为1 h，并用玻璃棒搅拌，使炭粉均匀受热，充分煎煮。将每次所得溶液用滤纸粗滤残渣后再用0.22 μm 微孔滤膜过滤，将两次滤液合并，浓缩并装入透析袋中透析7 d，定期换水。7 d 后取出透析液于4℃保存，留置待用。

2.2 GRRC-NCs 表征

取2 mL GRRC-NCs 透析液超声分散20 min，微孔滤膜过滤后抽取少量样品滴于200 目电镜专用铜网上，自然干燥后置于TEM 中，观察GRRC-NCs 的微观特征，并利用HR-TEM 观察其内部结构。利用UV-Vis 和FT-IR 观察GRRC-NCs的光学特征和表面官能团情况。将UV-Vis 预热30 min，用去离子水测定基线，测试条件：波长扫描范围为200 ～600 nm，带宽1.8 nm，速度5 nm·s－1。取3 mL GRRC-NCs 稀释液于比色皿中，测定其紫外光谱。称取160 mg KBr 粉末并将其与20 μL GRRC-NCs 透析液混合，烘干后研成细粉，并压制成质地透明的样片，测定GRRC-NCs红外吸收光谱。

2.3 水浸拘束法致大鼠应激性胃溃疡实验

大鼠同一环境下适应性喂养3 d，随后将其随机分为对照组、模型组、阳性药雷尼替丁组（50 mg·kg－1）及GRRC-NCs 低、中、高剂量组，共6 组，每组8 只。对照组与模型组给予生理盐水，GRRC-NCs 给药组剂量按成人用药剂量每日0.143 g·kg－1[1]、0.394 g·kg－1、0.789 g·kg－1[12-13]换算成大鼠用药剂量为0.85 g·kg－1、2.37 g·kg－1、4.73 g·kg－1（以GRRC 的质量计算）。每组灌胃体积均为10 mL·kg－1，每日给药一次，连续灌胃5 d。给药第4日后开始禁食，期间自由饮水，共计24 h。末次灌胃给药30 min 后造模，除对照组外各组大鼠放入自制大鼠固定器，浸入22～24 ℃水中，水面平于胸骨剑突，6 h 后取出。

2.4 标本采集与检测

造模结束后立即腹腔注射4%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，室温静置2 h 后，4℃3000 r·min－1离心15 min 分离血清，按照ELISA 试剂盒说明书测定血清中IL-6、TNF-α、5-HT 的含量。结扎幽门和贲门，收集胃液，pH 试纸检测胃液pH 值。取出全胃，沿胃大弯剪开，生理盐水清洗胃内容物后用滤纸吸干，将胃黏膜向上展开平铺于冰上，观察其损伤情况。拍照记录评价溃疡程度后，剪取一半胃组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色观察胃组织病理变化。

胃黏膜溃疡指数（UI）采用评分法简介评分，按Guth[14]标准计算分值：斑点状糜烂计1 分，溃疡糜烂长度＜1 mm 计2 分，溃疡糜烂长度在1 ～2 mm 计3 分，溃疡糜烂长度在2 ～3 mm 计4 分，糜烂长度＞3 mm 计5 分，宽度＞1 mm 时分值×2，最后将所得分相加。

溃疡抑制率/%＝（模型组平均UI－给药组平均UI）/模型组平均UI×100%。

2.5 数据分析

采用SPSS 20 统计学软件分析数据，结果以±s表示。多组间比较采用单因素ANOVA 方差分析方法，组间两两比较则运用LSD 方法分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 GRRC-NCs 表征结果

利用TEM 观察GRRC-NCs 的微观特征，见图1A，GRRC-NCs 粒径分布比较均一，在0.8 ～4.8 nm，主要集中在2 nm 左右，符合正态分布特征（见图1B）。高分辨透射电镜结果显示，GRRC-NCs 呈类球形，晶格间距为0.319 nm，晶格结构清晰（见图1C）。根据UV-vis 结果显示，GRRC-NCs 在255 nm 左右可见一微弱的吸收峰，这可能是由于C、O、N 元素的n-σ*跃迁所致（见图1D）。根据FT-IR 结果显示，红外吸收峰分别为3431、2921、1630、1384、1036 cm－1，提 示GRRC-NCs 表面存在氨基、羰基和羟基等功能基团（见图1E）。根据文献[15-16]分析可知吸收峰在3431 cm－1提示为-OH 和-NH 的伸缩振动峰，2921 cm－1处的吸收峰提示为CH3-和CH2-中的C-H 伸缩振动峰，1630 cm－1处的吸收峰提示可能为-C ＝O 键的伸缩振动峰，1384 cm－1处的吸收峰提示可能为C-N 的弯曲振动，1036 cm－1处的吸收峰提示可能为C-O 键的伸缩振动峰。

图1 GRRC-NCs 的微观结构及光谱特征组图Fig 1 Microstructure and spectral characteristic group of GRRC-NCs

3.2 药理实验结果

3.2.1 GRRC-NCs 对大鼠胃组织形态学的影响 如图2所示，对照组大鼠胃黏膜完整光滑，无损伤性改变，可见生理性皱襞。模型组胃黏膜充血糜烂，可见大量出血点及条索状血痂，呈黑褐色，清洗时有血块脱落，胃黏膜损伤严重。与模型组相比，各给药组胃黏膜出血情况均有减轻。其中GRRC-NCs 高剂量组和低剂量组仍有较明显的点状、线状出血及溃疡面，而GRRC-NCs 中剂量组和阳性药雷尼替丁组偶见轻微点状或短线状出血，部分大鼠胃黏膜无肉眼可见损伤。

3.2.2 GRRC-NCs 对大鼠胃黏膜溃疡指数、溃疡抑制率的影响 如图2A 所示，与对照组比较，模型组大鼠的溃疡指数具有显著差异（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组和GRRC-NCs 各剂量组溃疡指数明显减少（P＜0.01），其中GRRCNCs 中剂量组的溃疡指数低于阳性药雷尼替丁组（P＜0.05）。且GRRC-NCs 中剂量组溃疡抑制率为85.88%，明显高于阳性药组的65.54%（见图2B）。

图2 GRRC-NCs 对大鼠胃溃疡程度的影响Fig 2 Effect of GRRC-NCs on the degree of gastric ulcer in rats

3.2.3 GRRC-NCs 对SGU 大鼠胃组织病理学的影响 如图3所示，对照组大鼠胃组织黏膜无损伤。模型组大鼠胃组织黏膜可见明显带状损伤，上皮不完整，腺体紊乱，红细胞溢出明显，黏膜表面有较多组织碎片。阳性药组损伤及出血范围较小，腺体排列整齐。GRRC-NCs 低剂量组仍有明显出血及损伤，GRRC-NCs 高剂量组红细胞溢出不明显，但腺体排列不整齐，GRRC-NCs 中剂量组上皮黏膜连续完整，腺体结构整齐，出血不明显。

图3 应激性胃溃疡大鼠胃组织病理学切片（HE，×100）Fig 3 Pathological section of stomach in rat with stress gastric ulcer（HE，×100）

3.2.4 GRRC-NCs 对大鼠胃液pH 值的影响 如图4所示，与对照组比较，模型组胃液pH 值明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组胃液pH 值均有升高，其中GRRC-NCs 中剂量组与阳性药组有明显升高（P＜0.01），GRRC-NCs 低剂量与高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。表明GRRC-NCs 能够升高胃液pH 值，减少胃酸对胃黏膜的损害。

图4 GRRC-NCs 对大鼠胃液pH 值的影响Fig 4 Effect of GRRC-NCs on pH value of gastric juice in rats

3.2.5 GRRC-NCs 对大鼠血清中TNF-α、IL-6 及5-HT 的影响 如图5A 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TNF-α含量均有明显降低（P＜0.01）。如图5B 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中IL-6 含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组IL-6 含量均有降低，其中阳性药组与GRRC-NCs 中、高剂量组有显著差异（P＜0.01），GRRC-NCs 低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。如图5C 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中5-HT 明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组5-HT 含量均有明显降低（P＜0.01）。

图5 GRRC-NCs 对大鼠血清炎症因子和五羟色胺含量的影响Fig 5 Effect of GRRC-NCs on serum inflammatory factors and serotonin in rats

4 讨论

近年来，随着纳米技术的深入研究，碳点因为具有良好的生物相容性及安全性使其在生物成像、疾病探测、细胞标记等领域得到广泛应用[17-19]。在前期工作中，本团队已经证明了碳点是炭药发挥药效作用的物质基础，且具有良好的止血、抗炎、镇痛等作用。前期研究中本团队通过酒精性胃溃疡模型，发现GRRC-NCs 可以提高机体的抗氧化能力，减轻酒精代谢过程中产生的自由基，从而降低胃溃疡程度[11]。本研究初步证实GRRC-NCs 是通过降低损伤因子的表达，调节应激反应，来保护胃组织。

SGU 是消化系统的常见病，现代医学研究表明SGU 是机体对内外环境刺激作出的非特异性防御适应反应，受到整体因素如神经-内分泌-免疫系统和中枢神经的调节。其中枢机制可能是通过下丘脑-交感神经系统、下丘脑-迷走神经系统及下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA 轴）发挥作用，并进一步影响胃酸分泌及胃黏膜血流量导致溃疡产生[20]。胃酸是导致胃黏膜损伤的主要因素之一，而应激后机体交感神经与副交感神经兴奋性增加，使胃肠道运动和胃酸分泌紊乱，造成胃黏膜损伤并产生炎症。当炎性因子过量表达，导致机体细胞免疫反应和体液免疫反应，使胃黏膜免疫反应过度亢进导致胃损伤。TNF-α是可造成组织广泛损伤的促炎症因子，影响溃疡愈合质量。TNF-α高浓度时还能促进IL-6 等相关炎症因子的产生及分泌[21]。有研究表明IL-6 通过兴奋中枢迷走神经胆碱能神经元，导致外周胃泌酸的增加以及胃分泌功能紊乱，从而加重了SGU 的形成[22]。

中枢神经系统5-HT 与水浸拘束应激有密切的关系，是应激中很活跃的神经递质，参与多种应激反应的调节，是一种抑制性神经递质。5-HT含量的改变，能引起下丘脑、垂体功能的相应变化，外围或中枢给予5-HT 可影响胃酸分泌[23]。5-HT 通过其受体发挥生物学效应，具有抑制胃酸和胃蛋白酶的分泌，加速胃肠道收缩、蠕动及参与肠液的分泌及肠道对电解质的转运作用[24]。

综上所述，GRRC-NCs 对SGU 大鼠胃黏膜组织有明显保护作用，为甘草炭和其他炭药的研究提供了新的理论基础。这不仅为中药炭药的物质基础研究提供了一个新思路，也为GRRC-NCs在胃溃疡领域的应用提供了新的见解，并为未来的药物发现奠定了坚实的基础。