新藤黄酸纳米乳的制备、表征以及体外抗肿瘤药效学的研究

尹孝莉，周思敏，吴方雨，魏晴，王雷，2，3，4，5，陈卫东，2，3，4，5*（.安徽中医药大学药学院，合肥 23002；2.中药复方安徽省重点实验室，合肥 23002；3.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，合肥 23002；4.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，合肥 23002；5.现代药物制剂安徽省工程技术研究中心，合肥 23002）

癌症是当今世界的一个主要公共健康问题，许多化学药物均可引起不同的不良反应[1-2]。越来越多的证据表明，传统中药在各种癌症的治疗中已引起广泛关注[3-6]。新藤黄酸（gambogenic acid，GNA，C38H47O8，结构见图1）是从传统中药藤黄中分离得到的生物活性成分，具有多种抗肿瘤活性[7]，例如肝癌（HepG2）[8]、肺腺癌[9]、人鼻咽癌[10]、多发性骨髓瘤[11]、脉络膜黑色素瘤[12]等，还可能是逆转P-糖蛋白介导的多药耐药性的潜在抑制剂[13]，因此有望成为一种新型的抗肿瘤结构药物。但是GNA 水溶性差、血管刺激较大，限制了它的临床应用[14]，亟需适当的制剂以改善GNA 的缺陷。

图1 GNA 的化学结构Fig 1 Chemical structure of GNA

目前，关于GNA 的研究主要集中于注射剂。如Huang 等[15]采用高温乳化-低温固化的方法成功研制了注射剂GNA 固体脂质纳米粒；Yuan 等[16]采用反溶剂沉淀法制备了以PVPK30 和PEG2000为稳定剂的注射型GNA 纳米悬浮液（GNA-NS）；Luo 等[17]制备了注射剂GNA 脂质立方液晶纳米粒；Lin 等[14，18]制备了注射型长循环纳米脂质载体及PEG 化非离子表面活性剂等纳米载体来包裹GNA；Liu 等[19]制备了负载GNA 的注射型pH 响应聚合物胶束（PMS）。虽然静脉内给药具有许多优点，但是鉴于口服给药便利、可减少并发症，尤其是能有效地解决血管刺激性问题，而静脉注射的成本高，因此，本文旨在制备出一种优良的口服制剂来解决GNA 现存的不足。

纳米乳是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成，粒径为10 ～100 nm，热力学稳定、各向同性的透明或半透明的均相分散体系[20]。纳米乳一般被用作载体来增加难溶性药物的溶解度、提高药物的稳定性及生物利用度。在蒿甲醚纳米乳的制备中，纳米乳显著提高了蒿甲醚在水中的溶解度，且粒径小，稳定性好，体内口服生物利用度比普通药物高2.6 倍[21]。纳米乳还能减少药物的不良反应，起到缓释效应和增强药物的被动靶向性的作用。如将氨苯砜制成纳米乳后，不仅改善了溶解度，减少了药物的必要剂量和不良反应，还提高了药物生物利用度和稳定性[22]。随着纳米剂型的快速发展，国内外关于纳米乳的研究越来越多，通过纳米乳来改善药物缺陷的报道也越来越多，如吡罗昔康[23]、阿伐那非[24]、灯盏花素[25]等；另外，纳米乳还被用来增加疫苗的免疫作用[26]。众多研究表明，纳米乳在改善药物自身缺陷和提高药效方面具有广泛的应用前景，并可以通过各种途径如口服、透皮和静脉注射等递送药物，尤其是口服制剂，在其中占据了较大的比例[27-28]。因此，将GNA 制成纳米乳口服给药将是一个优良的选择。

本研究主要基于GNA 的局限性设计开发了新藤黄酸纳米乳（GNE）：首先通过溶解度实验筛选出对GNA 溶解度最大的赋形剂，并利用伪三元相图和单因素的考察优化纳米乳的配方；然后通过外观、类型、粒径、多分散系数、透射电镜、稀释稳定性和放置稳定性等方法系统地表征GNE；最后通过体外药效学来证明纳米乳增加了GNA 的药效。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20AXR 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB135-S 型十万分之一电子分析天平（德国Mettler Toledo 公司）；DF-101B 集热式恒温磁力搅拌器（金坛市鑫鑫实验仪器厂）；LC-4016 低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；TG16-WS 高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；Zetasizer3000HS 型激光粒度仪（英国Malvern 公司）；Hitachi-HT7700 透射电镜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；KQ-300B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海傅讯实业有限公司）；ESCO 二氧化碳培养箱（新加坡Esco 公司）；YM50B 型高压蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）；酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；注射泵（上海蓝德医疗器械有限公司）；Cascada 超纯水仪（美国PALL 公司）。

1.2 试药

新藤黄酸（GNA）对照品（纯度≥ 98%，安徽中医药大学药学院 GNA 课题组提供）；亚麻籽油、橄榄油、油酸乙酯、中碳链三酰甘油（MCT）（上海源叶生物科技有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；蛋黄卵磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40，江苏省海安石油化工厂）；泊洛沙姆188（F68，德国BASF 公司）；吐温80、甘油、聚乙二醇400（PEG400）（上海润捷化学试剂有限公司）；1，2-丙二醇（上海苏懿化学试剂有限公司）；异丙醇（天津市大茂化学试剂厂）；苏丹红（天津市科密欧化学试剂有限公司）；三水合亚甲蓝（西陇科学股份有限公司）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清（美国Hyclone 公司）；胰酶细胞消化液（Biosharp 公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Sigma 公司）；青霉素-链霉素溶液（碧云天生物技术）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

乳腺癌4T1 细胞购自中国科学院上海细胞所（传代4 次）。

2 方法与结果

2.1 GNE 的制备

2.1.1 油相和助表面活性剂的确定 各取1 mL的油相和助表面活性剂于离心管中，加入过量的GNA，室温振荡48 h，15 000 r·min－1离心5 min后取上清液，甲醇稀释适宜的倍数后，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，采用HPLC 在360 nm 测定GNA的含量。计算GNA 在不同油相、助表面活性剂中的溶解度，其结果见图2A。GNA 分别在油相MCT和助表面活性剂PEG400 中GNA 的溶解度最高，因此选择MCT 为油相，PEG400 为助表面活性剂。

2.1.2 表面活性剂的确定 各取50 mg 的表面活性剂于离心管中，加水稀释成10.83 mg·mL－1的胶束溶液，加入过量的GNA，室温振荡48 h，15 000 r·min－1离心5 min 后取上清液，甲醇稀释适宜的倍数后，用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，采用HPLC 在360 nm 测定GNA 的含量。计算GNA在不同表面活性剂中的溶解度，其结果见图2B。结果显示，GNA 在表面活性剂RH40 中的溶解度最高，因此选用RH40 为纳米乳的表面活性剂。

图2 GNA 在不同油相（A）、助表面活性剂（A）和表面活性剂（B）中的溶解度Fig 2 Solubility of GNA in oil phases（A），co-surfactants（A）and surfactants（B）

2.1.3Km的确定 由图2可知，以溶解度最大的MCT、RH40 和PEG400 分别作为油相、表面活性剂和助表面活性剂。采用伪三元相图的方法，在室温条件下，将表面活性剂与助表面活性剂按不同质量比（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）振荡摇匀后，再将混合表面活性剂与MCT 按不同质量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）振荡混匀，滴入水相。以混合表面活性剂、油相和水分别为一条边，记录体系从浑浊到澄清时所用水相的体积，计算各组分的质量百分数，用Origin 软件绘制伪三元相图[29]（Km为表面活性剂与助表面活性剂质量比，阴影面积为乳化区域），其结果如图3。

图3 MCT/RH40/PEG400/水纳米乳伪三元相图Fig 3 Pseudo ternary phase diagram of MCT，RH40，PEG400 and water with different Km

当Km＝1/2、Km＝1、Km＝3 时无法形成伪三元相图，在Km值为2 时，纳米乳区域面积最大，因此选择Km值为2。同时为增加GNA 的载药量，减少表面活性剂的用量，选择阴影区域中油相和表面活性剂比为3∶7 的点作为后续纳米乳的处方（油相最多，载药最多，混合表面活性剂最小）；即空白纳米乳的最优处方为：MCT/RH40/PEG400/水（0.3∶0.47∶0.23∶1.0）。为 便于后续单因素实验的考察，精密称取MCT 0.9 g、RH40 1.4 g、PEG400 0.7 g 和水3 g 进行实验。

2.1.4 转速的确定 固定其他因素不变，考察搅拌速度对评价指标的影响。结果见表1，可以看出，转速的大小对于纳米乳的外观无明显的影响，但粒径和多分散系数（PDI）均随着搅拌速度的增加，先减小后增大。其中，当转速在400 r·min－1时粒径和PDI 均最小，故选择搅拌速度为400 r·min－1。

表1 搅拌速度对空白纳米乳外观、粒径和PDI 的影响Tab 1 Influence of stirring velocity on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.5 滴加速度的确定 固定其他因素不变，通过注射泵控制滴加速度，考察滴加速度对评价指标的影响。结果见表2，可以看出，滴加速度对于纳米乳的外观无明显的影响，但粒径和PDI 均在滴加速度为0.3 mL·min－1和0.7 mL·min－1时较优。从节省时间成本上的考虑，选择滴加速度为0.7 mL·min－1。

表2 滴加速度对空白纳米乳外观、粒径和PDI 的影响Tab 2 Influence of drop acceleration on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.6 温度的确定 固定其他因素不变，考察温度对评价指标的影响。结果见表3，可以看出，温度对于纳米乳的外观无明显的影响，但对粒径和PDI 均有较大的影响，其中在50 ℃时粒径最小，在40 ℃时PDI 最小，两者相差不大，从节约能源的角度考虑，选择温度为40℃。

表3 温度对空白纳米乳外观、粒径和PDI 的影响Tab 3 Influence of temperature on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.7 GNE 的制备 精密称取MCT 0.9 g、RH40 1.4 g、PEG400 0.7 g 于锥形瓶中，在40℃下用磁力搅拌器以400 r·min－1的转速搅拌混匀，然后用注射泵以0.7 mL·min－1的滴加速度缓慢滴加3 g 水于混合体系中，搅拌至澄清透明即得空白纳米乳。最后多次少量地将36 mg GNA 粉末加入空白纳米乳中[30-31]，直至搅拌完全溶解，即得6 mg·mL－1的淡黄色澄清透明纳米乳制剂。

2.2 GNA 分析方法的建立

2.2.1 GNA 对照品溶液的配制 精密称取GNA对照品4.99 mg 于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，再精密吸取0.1 mL 并用甲醇稀释为4.99 μg·mL－1，涡旋混合即得GNA 对照品溶液，置于4℃冰箱中储存备用。

2.2.2 GNA 供试品溶液的配制 吸取一定体积的GNE 于10 mL 量瓶中，加入适量甲醇涡旋，超声使其完全破乳，再加入甲醇定容至刻度线即得GNE 破乳溶液，现配现用。

2.2.3 空白纳米乳的配制 吸取等量的空白纳米乳于10 mL 量瓶中，加入适量甲醇涡旋，超声使其完全破乳，再加入甲醇定容至刻度线即得空白纳米乳破乳溶液，现配现用。

2.2.4 色谱条件 采用COSMOSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（90∶10，V/V），流速为1.0 mL·min－1，检测波长为360 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。

2.2.5 方法学验证 对所建立的 HPLC 方法进行方法学考察，结果见图4。可以看出辅料对GNA 的含量测定无干扰，表明此方法的专属性好。其线性关系、日内精密度、日间精密度、回收率、重复性及稳定性均符合体外分析的要求（RSD值均小于5%）。

图4 GNA 的HPLC 色谱图Fig 4 HPLC chromatogram of GNA

2.3 包封率和载药量的测量

结合课题组的前期研究，选择微柱离心法作为测量GNA 的主要方法。精密吸取稀释后的GNE 100 μL 于葡聚糖凝胶柱顶端中央，3000 r·min－1离心3 min 后，在顶端加入100 μL 的超纯水，连续洗脱5 次，收集并合并滤液，加甲醇定容至2 mL，按“2.2.4”项下方法测定GNA 含量，计算GNA 的包封量（W包封）。另取GNE 100 μL，直接用甲醇定容至2 mL，按“2.2.4”项下方法测定GNA 含量，计算GNA 的量（W总）。包封率（EE%）和实际载药量（DL%）的计算公式如下：

其中，W包封是被包裹在纳米乳里的GNA 质量，W总是投的GNA 总量，W载体是除水后纳米乳空白载体的质量。根据计算公式，可得出GNE的包封率为93.50%，实际载药量为1.11%。

2.4 GNE 的质量评价

2.4.1 纳米乳外观考察 由图5可知，所制备的空白纳米乳是外观带有淡蓝色乳光的澄清透明的液体，没有沉淀或絮凝，而GNE 则呈现黄色。

图5 空白纳米乳（左）和GNE（右）的外观Fig 5 Outward appearances of the blank nanoemulsiom （left）and GNE（right）

2.4.2 鉴别实验 各取两份GNE 1 mL 于进样小瓶中，分别滴加苏丹红（红色油性染料）和亚甲基蓝（蓝色水性染料）1 滴，结果观察到蓝色的扩散速度快于红色，如图6，表明所制备的GNE 为水包油型。

图6 纳米乳的鉴别实验（左-苏丹红；右-亚甲基蓝）Fig 6 Identification experiment of GNE （left-Sudan red；rightmethylene blue）

2.4.3 形态学考察 将铜网置于干净的载玻片上，滴加10 μL 稀释适量倍数的GNE 静置挥干，然后用2%的磷钨酸染色2 min，用滤纸吸去多余的染液，置透射电镜下观察，如图7。结果显示GNE 外观呈类球型，大小均匀，表面光滑圆整，粒子间无粘连。

图7 GNE 透射电镜图Fig 7 Transmission electron microscope of GNE

2.4.4 粒径分布与Zeta 电位 取GNE 1 mL，用外相水稀释至50 mL，用激光粒度分析仪分别测定其粒径和Zeta 电位，结果显示GNE 的平均粒径为（45.28±0.32）nm，多分散指数（PDI）为（0.137±0.01）；Zeta 电位为（－10.5±0.52）mV。由此可知，制备的GNE 粒径分布窄，大小均匀，符合纳米制剂的要求（见图8）。

图8 GNE 的粒径分布图（A）及Zeta 电位图（B）Fig 8 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of the GNE

2.4.5 稀释稳定性 取等量的GNE 用水稀释至不同的倍数（20、100、400、800 倍），观察GNE的外观，测定其平均粒径、PDI。结果显示，纳米乳外观保持稳定，呈淡黄色，无絮凝、沉淀和分层等现象，粒径和PDI 均稍微增大，但都在允许范围内（粒径 ＜200 nm，PDI ＜0.3），具有较好的稀释稳定性，见图9。

图9 GNE 的稀释稳定性Fig 9 Dilution stability of GNE

2.4.6 放置稳定性 将GNE 分别放置于4℃及25℃条件下，分别于0、7、14、21 和28 d 时取出，观察GNE 的外观，测定其平均粒径、PDI、包封率，初步评价GNE 的放置稳定性。结果表明在4℃下，GNE 一直呈淡黄色透明液体，4 周内的平均粒径略有增加趋势，PDI 变化不明显，包封率稍有下降；但在25℃下纳米乳第3 周就变得稍微浑浊，平均粒径、PDI 和包封率均有较大的变化（见图10）。说明温度会对纳米乳的放置稳定性产生一定的影响，GNE 在4℃环境中放置4 周是相对稳定的。

图10 GNE 在4 和 25 ℃环境中的放置稳定性（A.粒径；B.多分散系数；C.包封率）Fig 10 Storage stability of GNE at 4 and 25℃ for 4 weeks（A.size；B.PDI；C.Encapsulation efficiency）

2.5 GNE 的体外抗肿瘤活性

2.5.1 细胞培养 将4T1 细胞培养于含有10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基，并放在37℃，5%CO2的恒温、恒湿的无菌培养箱中，定期更换培养液，待细胞铺满培养瓶底部90%时进行下一步实验。

2.5.2 细胞活力实验 选择MTT 法研究细胞活力实验。将细胞以1×105个/孔的密度接种在96 孔板中，培养24 h 后，加入不同浓度的游离GNA，空白纳米乳和GNE 到细胞中温育24 h，并向每个孔中加入20 μL MTT 溶液（5.0 mg·mL－1），温育4 h，除去培养基，加入150 μL DMSO，摇晃10 min。用酶标仪在490 nm 处测定各孔光密度（OD）值，记录实验结果，计算细胞存活率，细胞存活率（%）＝OD给药/OD空白×100%其中，OD给药、OD空白分别代表给药组和空白对照组的OD值，根据上式计算出各浓度所对应的细胞存活率的柱状图，并采用GraphPad prism 5 拟合计算半数抑制浓度（IC50），见图11。

图11 GNA 和GNE 对4T1 细胞的存活率的影响（ ±s，n ＝3）Fig 11 Effect of GNA and GNE on the cell viability of 4T1 cells（ ±s，n ＝3）

MTT 结果显示，GNA 以及GNE 对4T1 细胞均有明显的抑制作用，且随着浓度的升高，抑制程度增强。空白纳米乳在8.0 μmol·L－1（即5048 μg·mL－1）时对细胞有微弱的毒性，但细胞存活率达到80%，根据部分文献报道，可认为该载体是安全无毒的[32-33]。且从图11 中可以看出，GNE较GNA 而言细胞存活率下降更加明显，IC50值更小，是游离GNA [IC50值（6.041 μmol·L－1）]的0.55 倍，这表明纳米乳包裹后的GNA 相对于游离药物，其抑制细胞增殖的能力提高了，对癌细胞的毒性增大了，因此其抗肿瘤活性得到增强。

3 讨论

GNA 和藤黄酸均是从藤黄科植物藤黄中分离提取出来的有效活性成分，但GNA 表现出更强的抗肿瘤作用。曲宝玺等[34]通过实验发现GNA 对小鼠白血病的抑制作用优于藤黄酸，最高生存期延长率可达292%，而藤黄酸最高只达到119%。并且GNA 对正常细胞（如人脐静脉内皮细胞HUVEC）不敏感，不影响脾、肾等主要器官的生理功能[35]，是一种极具开发前景的天然抗肿瘤药物。尤其是在藤黄酸Ⅲ期临床失败以后，GNA 的研究变得更为重要。本文旨在通过制备纳米乳来改善GNA 的脂溶性强、水溶性差的问题，并以期通过改变给药方式从而避免其血管刺激性。

在纳米乳的制备上，首先挑选符合2020年版《中国药典》规定的几种不同辅料，再根据溶解度实验，筛选对GNA 溶解度最大的油相、表面活性剂和助表面活性剂，决定出纳米乳的组分因素。虽然该成分组成的伪三元相图纳米乳区域小，但稳定性良好，且文献鲜少报道，具有一定的研究价值。在投药量的选择上，本研究将过量的GNA 多次少量地加入到事先制备好的空白纳米乳中。冷藏24 h 后，出现沉淀；表明添加的60.23 mg GNA 不能被纳米乳剂完全溶解。所以通过低速离心（3000 r·min－1）将沉淀物与载有GNA 的纳米乳剂分离[36]。然后取上清液溶于甲醇测定GNA 含量，得纳米乳的最大载药量为56.16 mg；考虑到GNE 的长期稳定性，根据预实验选择了36 mg 为纳米乳的投药量用于后续实验。该制剂存在的不足地方是Zeta 电位的绝对值不够大，但Zeta 电位并非是考察稳定性因素的唯一评价指标。文献表明，即使Zeta 电位绝对值小于20 mV，结果依然表现出良好的稳定性[37-38]。此外，在MTT 实验中，空白纳米乳对肿瘤细胞有微弱的毒性，可能是由于空白纳米乳辅料量较大的原因。空白纳米乳同GNE 制备方法一致，辅料量一样，若降低了GNE 的辅料量，则可降低空白纳米乳的辅料量。因此根据载药量的计算公式，在控制药量相等的情况下，提高载药量是减少辅料量的有效途径，但载药量低是传统纳米载药系统的通病，比如GNA PEG 化脂质体、纳米脂质体和叶酸靶向磁性纳米粒的载药量分别仅为3.72%、4.23%和4.35%[7，39-40]，肉豆蔻香精油纳米乳的载药量为1.11%～4.12%[41]。因此，越来越多的人通过将药物与辅料化学键合来提高载药量，在摄取相同剂量药物时，载药量大的制剂摄取的辅料量少，从而达到减少辅料毒性的目的[42-43]。

本文通过制备经口给药纳米乳改善了GNA 的不足，并通过外观、类型、粒径、PDI、透射电镜、稀释稳定性和放置稳定性等方法对其进行了系统的表征；体外细胞药效学也初步证明了纳米乳可以增强GNA 对肿瘤的抑制作用。虽然涉及的内容范围较少，但后期课题组会通过细胞毒性试验、体外释放试验、流式细胞术、安全性试验等进行进一步的考察，以期为其用于临床研究提供理论基础。