布地奈德脂质体制备工艺优选及质量评价

马瑞丽，杨东亮，赵宇郁，周婧，马桂芝*（.新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 8300；.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是结肠的一种慢性免疫介导的炎症性疾病。在全球范围内，UC 的发病率呈上升趋势[1]。糖皮质激素是活动期UC 患者诱导治疗的重要药物[2-3]，对5-氨基水杨酸应答不佳的轻、中度UC，常需全身给予糖皮质激素治疗，但全身激素用药易导致诸多药物不良反应，如感染、库欣综合征、骨质疏松症等[4]。布地奈德（budesonide）是一种合成的第二代皮质类固醇类激素，在局部给药部位具有很强的抗炎作用，较其他皮质类固醇全身毒性小、不良反应少[5-7]，可抑制细胞免疫，减少炎性细胞浸润，稳定溶酶体膜，减低毛细血管通透性[8]，可有效诱导部分轻中度UC 患者的症状缓解[9]。

目前，临床上多采用吸入用布地奈德混悬剂灌肠[10]，然而普通混悬液几乎没有生物黏附性，在直肠的自身蠕动作用下，在肠道保留时间短，局部吸收差，且布地奈德几乎不溶于水，限制了药物的局部吸收效果，影响药物疗效。脂质体特殊的磷脂双分子层的膜结构可提高疏水性药物的分散度，增加药物溶解度，从而有可能增加布地奈德在直肠的局部吸收和局部药物浓度[11]，并且有报道称脂质体直接局部给药能提高局部治疗效果，降低全身给药的不良反应[12]。故本研究优选布地奈德脂质体的制备工艺，为后期该药直肠定向给药系统的研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 纳米激光粒径测定仪（英国马尔文仪器有限公司）；PS-1000 磁力搅拌器（东京理化器械株式会社）；3-18KS 台式高速冷冻离心机（SIGMA 公司）；VCX500 超声波细胞破碎仪（Sonics&Materials Inc）；Milli-Q 艾柯超纯水仪（美国密理博公司）；JEM-1230 透射电镜（日本电子株式会社）。

1.2 试药

布地奈德对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y13J7C9082，纯度≥98%）；布地奈德原料药（山东泰华生物科技有限公司，批号：20190906，纯度≥99%）；大豆磷脂（批号：SYSO-200401）、胆固醇（批号：B80859）（上海艾伟拓医药科技有限公司）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 脂质体中布地奈德含量的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）为流动相等度洗脱，检测波长260 nm，流速1 mL·min－1，柱温25℃；进样量10 µL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取布地奈德对照品适量，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成196.4 µg·mL－1的对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取布地奈德脂质体1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分震荡，摇匀，于4℃、15 000 r·min－1离心15 min，取上清液，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液适量，即得。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 制备不含布地奈德的空白脂质体，同“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 专属性考察 取布地奈德对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和空白溶剂甲醇各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图1。在阴性样品溶液的色谱图中对照品出峰位置无色谱峰，提示基质对布地奈德的测定无干扰。理论板数按布地奈德计大于8000。

图1 布地奈德脂质体的HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of budesonide liposomes

2.1.6 线性关系考察 精密移取对照品储备液适量，依次稀释，制成0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 µg·mL－1的系列对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积（y）为纵坐标，布地奈德的质量浓度（x）为横坐标，进行线性回归，得回归方程y＝1.59×104x＋1.993×103（r＝0.9999）。结果表明，布地奈德在0.38 ～98.2 µg·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 取同一批布地奈德脂质体，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进样，连续测定6 次，记录峰面积。结果峰面积的RSD为0.66%，说明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一批布地奈德脂质体，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在常温下分别于0、2、4、6、8、12 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果峰面积的RSD为0.82%，表明样品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 同一批布地奈德脂质体，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品浓度。结果样品的平均质量浓度为189.8 µg·mL－1，RSD为1.3%，表明本方法重复性良好。

2.1.10 加样回收试验 精密量取同一批已知质量浓度的布地奈德脂质体1.0 mL，共9 份，分别置于10 mL 量瓶中，加入不同体积的“2.1.2”项下的对照品储备液，按“2.1.3”项下方法制成低、中、高3 种质量浓度的供试品溶液各3 份，并按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率及RSD。结果低、中、高质量浓度的平均加样回收率在97.7%～100.2%，RSD均＜2%，表明本法准确度良好。

2.1.11 耐用性试验 取同一批布地奈德脂质体，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，参照“2.1.1”项下色谱条件进样，考察不同色谱柱（Agilent SB-C18，SN：USCL074978、Agilent SB-C18，SN：USCL082052、Kromasil C18）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min－1）、不同柱温（20、25、30℃）对测定结果的影响，记录峰面积并计算样品含量，结果不同色谱柱的峰面积RSD为3.1%，不同流速的峰面积RSD为2.7%，不同柱温的峰面积RSD为0.74%，表明该方法耐用性良好。

2.2 脂质体工艺优选指标——综合评分的计算

2.2.1 权重系数的设定与综合评分的计算 采用层次分析法[13]进行综合评分，以包封率、载药量和粒径作为考察指标，引入九分位的相对重要性比例标度，评估主体确定各指标的相对重要性，赋予各指标不同的分数，比较同一层次目标的相对重要性，并构成两两比较矩阵，见表1。得到包封率、载药量和粒径的归一化权重系数分别为0.7306、0.1884、0.0810。对其进行一致性检验，结果CR＝CI/RI＝0.0567 ＜0.1，表明权重系数合理。

表1 指标成对比较的判断优先矩阵Tab 1 Judgment priority matrix for pairwise comparison of indicators

结合层次分析法确定的权重系数，得到综合评分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306 ＋载药量/载药量最大值×0.1884 ＋粒径最小值/粒径×0.0810。

2.2.2 包封率和载药量的测定[14-15]采用低温超速离心法测定布地奈德脂质体的包封率和载药量。精密量取布地奈德脂质体500 µL 于10 mL 量瓶中，加入适量甲醇（接近刻度）超声15 min，破乳后用甲醇定容，混匀后过0.22 µm 的微孔滤膜，取续滤液20 µL 按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算布地奈德总量（C总）；取布地奈德脂质体适量于离心管中，低温（4℃）高速（18 000 r·min－1）离心60 min，取上清液500 µL 定容于10 mL 量瓶中，摇匀，过0.22 µm 微孔滤膜，取续滤液20 µL按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算游离的布地奈德（C游），按以下公式计算包封率和载药量：包封率＝（C总－C游）/C总×100%，载药量＝（W总－W游）/称样量×100%。

2.2.3 粒径的测定 取布地奈德脂质体乳液，用超纯水稀释10 倍后取适量于测定样品池中，通过马尔文纳米激光粒径测定仪对脂质体的粒径进行测定，每个样品平行测定3 次。

2.3 乙醚注入法的工艺优选

2.3.1 制备流程 精密称取布地奈德原料药、胆固醇、大豆磷脂适量于西林瓶中，加入5 mL 乙醚超声使其溶解。将乙醚溶液用注射器缓慢匀速注入到恒温的20 mL 超纯水中，边注入边磁力搅拌，另取2 mL 乙醚润洗西林瓶和注射器，同法注入到超纯水中，恒温搅拌1 h，使乙醚挥发尽后，超声分散，即得。

2.3.2 试验设计 根据预试验发现，超声分散时间、水合介质种类和搅拌速度对指标的影响较小，故确定以上三因素为固定因素，即超声分散15 min，水合介质为超纯水，搅拌速度为500 r·min－1。而膜材比（A）、脂药比（B）和水合介质温度（C）对指标影响较大，采用星点设计-效应面法优化该三因素组合，优选乙醚注入法制备布地奈德脂质体的工艺参数。试验因素水平见表2，结果见表3。

表2 星点设计-效应面法的因素水平表Tab 2 Factor and level of central composite design-response surface method

2.3.3 数据处理 采用Design-Expert 10.0.7 软件对表3数据进行拟合，得到综合评分Y的回归方程为Y＝0.8239－0.0184A－0.034B＋0.0112C＋0.0163AB＋0.0388AC－0.0315BC＋6.6697A2＋0.0178B2－3.3872C2。方差分析见表4。固定其中一个因素，绘制其他两个因素对综合评分的三维曲面图，结果见图2。

表3 星点设计-效应面法的结果Tab 3 Central composite design-response surface method

由表4可知，模型极显著（P＜0.0001），模型的R2＝0.9680，调整R2＝0.9393，说明此模型可以解释96.8%响应值的变化，表明模型能较好地反映膜材比（A）、脂药比（B）和水合介质温度（C）与综合评分（Y）之间的变化关系。失拟项P＞0.05，不显著，可认为无失拟因素存在。3 个因素中，A、B和C都为极显著项（P＜0.01）；两两交互项中，AC、BC和BC之间交互作用极显著（P＜0.01）。

表4 方差分析Tab 4 Analysis of variance

应用Design-Expert 10.0.7 软件对优选的制备工艺条件（即A＝12，B＝6，C＝60）进行预测，综合评分的预测值为0.926。

2.3.4 验证试验 结合实际操作条件，初步确定优选工艺参数为：膜材比12∶1，脂药比6∶1，水合介质温度60℃。按照优选参数，采用乙醚注入法制备3 批布地奈德脂质体。结果3 批布地奈德脂质体平均包封率为75.63%，载药量为9.17%，粒径为276 nm，包封率、载药量和粒径的综合评分与预测值相比相对误差均小于3%，说明工艺稳定，重现性好，结果见表5。

图2 布地奈德脂质体制备工艺优化的效应面图Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表5 验证试验结果(n ＝3)Tab 5 Verification test (n ＝3)

2.4 薄膜分散法的工艺优选

2.4.1 工艺流程 精密称取布地奈德原料药、胆固醇、大豆磷脂适量于250 mL 的圆底烧瓶中，加入10 mL 氯仿超声使其溶解。置于旋转蒸发仪，在真空恒温水浴条件下，旋转蒸发除去有机溶剂，使得脂质材料在圆底烧瓶内壁形成一层透明状的均匀薄膜，增大真空度除去残留有机溶剂。加入超纯水20 mL，摇晃至均匀混合，恒温水浴下常压旋转水合30 min，冰浴条件下探头超声（超2 s，停3 s），即得。

2.4.2 试验设计 在预试验中采用单因素试验考察了膜材比、脂药比、有机溶剂种类、水合介质种类、旋蒸温度、超声功率和超声时间7 个因素对指标的影响，结果表明膜材比、有机溶剂种类、水合介质种类、旋蒸温度和超声功率对指标的影响较小，可作为固定因素，其因素水平固定为膜材比12∶1、有机溶剂为氯仿、水合介质为超纯水、旋蒸温度为20℃，超声功率为30%。脂药比（A）和超声时间（B）对指标影响较大，采用星点设计-效应面法优选薄膜分散法的最佳制备工艺。结果薄膜分散法最佳工艺制备的脂质体平均包封率为67.09%，平均载药量为7.56%，平均粒径为279.87 nm。

2.5 制备方法的确定

通过对乙醚注入法和薄膜分散法的数据进行比较，发现乙醚注入法制备的布地奈德脂质体的包封率、载药量和综合评分都相对较高，故最终确定乙醚注入法为布地奈德脂质体的制备方法。

2.6 最优处方布地奈德脂质体的质量评价

2.6.1 形态观察 在室温条件下，取适量最优处方制备的布地奈德脂质体原液，滴于铜网上静置5 min 后，用滤纸吸掉多余混悬液，用2%磷钨酸负染30 s 后晾干，置于透射电镜下观察并拍照，如图3所示。透射电镜结果显示，脂质体粒子小而均匀，呈球形，且粒子大小与粒径测定结果基本吻合。

图3 不同倍数及标尺下布地奈德脂质体的透射电镜图Fig 3 Transmission electron micrograph of budesonide liposomes at different multiples and scales

2.6.2 包封率和载药量的测定 按“2.2.2”项下方法测定布地奈德脂质体的包封率和载药量，结果其包封率为（75.63±1.1）%，载药量为（9.17±0.4）%。

2.6.3 粒径、分散指数和电位的测定 按“2.2.3”项下方法测得布地奈德脂质体的平均粒径为（276±32.9）nm，PDI 为（0.35±0.1），平均Zeta电位为－（44.87±5）mV。布地奈德脂质体的粒径和Zeta 电位分布见图4。

图4 布地奈德脂质体的粒径（A）和Zeta 电位分布（B）Fig 4 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of budesonide liposomes

3 讨论

布地奈德一般采用高效液相法进行含量测定[16]，本文采用二极管阵列检测器对对照品溶液进行全波长扫描发现，布地奈德在244 nm 波长处有最大吸收，但在该波长处，溶剂甲醇会对样品的测定产生干扰。通过改变色谱条件、流动相比例、柱温等依然无法排除溶剂的干扰，故最终选择溶剂在布地奈德出峰的位置没有干扰的260 nm 作为含量测定的检测波长。

在预试验中曾以包封率、载药量、粒径、PDI和电位5 个指标作为评价制备工艺的参数，但单因素试验结果表明，各考察因素的水平值的改变对PDI 和电位并无显著影响，故最终只选择包封率、载药量和粒径3 个指标。为保证评价结果的科学性和合理性，本试验采用层次分析法对多指标进行赋权，以加权后综合评分为因变量，不仅能全面地反映各检测指标对脂质体的重要程度，也能直观地反映整体制备工艺。

薄膜分散法和溶剂注入法是制备脂质体时较常用的两种方法。本试验采用薄膜分散法制备布地奈德脂质体时发现，脂质体粒径太大。通过物理方法探头超声或者过膜之后，粒径都有所减小，但脂质体的包封率会明显降低，这可能与薄膜分散法制备的脂质体粒径本身比较大有关（有文献报道薄膜分散法制备的脂质体粒径一般在1 ～5 µm[17]），而物理方法处理时对脂质体膜壁会造成一定的破坏，导致包封率显著降低。而乙醚注入法制备的脂质体本身粒径就比较小，一般在50 ～200 nm[17]，无需再通过物理方法来减小粒径，因此包封率较高。

综上所述，本文建立的测定布地奈德脂质体含量的高效液相检测方法准确可靠、专属性强，优选的制备工艺简单稳定，重现性好，可用于布地奈德脂质体的制备。